Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Nota: Una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1. 1. pianificazione della strategia di clonazione Selezionare due proteine interagenti putativamente da testare.Nota: Ciascuna delle due proteine verrà fusa a un frammento di Spalato-BioID: NBirA * o CBirA *. Come controllo negativo, le proteine di fusione CBirA * saranno testate con fusa per la proteina fluorescente verde NBirA * (NBirA *-GFP). Come un ulteriore controllo, le fusioni NBirA * possono essere collaudate da solo, senza cognate CBirA * fusione oppure in combinazione con un CBirA * fusa ad una proteina non correlata. È consigliabile non utilizzare CBirA *-GFP come controllo negativo come esso è stato indicato per portare costantemente a sfondo principale quando combinato a qualsiasi NBirA * fusione proteina9. La causa di questa osservazione potrebbe essere il livello di espressione di CBirA *-GFP, molto superiore a qualsiasi altro CBirA * proteine di fusione che abbiamo usato finora, che possono portare a significativi riassociazione con il frammento di NBirA. Dopo aver selezionati due proteine, controllare la letteratura per trovare se entrambi sono già stati correttamente etichettati negli studi funzionali (per esempio come una proteina di fusione GFP-etichettato). In presenza di tali studi, si noti la posizione del tag (a N – o C-terminale) e utilizzare lo stesso orientamento di codificare le proteine di interesse con i frammenti di Spalato-BioID. Se non esiste nessun tale studio, piano costrutti codificanti per entrambe le proteine taggati a N – e C-terminale e piano un test per verificare la funzionalità delle proteine di fusione (ad esempio, un esperimento di salvataggio in una linea cellulare impoverito per la proteina WT).Nota: Quando si accoppia due proteine di fusione utilizzando plasmidi che codificano linker flessibile lungo descritti nella Figura 2 , l’orientamento delle proteine di fusione (BirA * frammenti con fusibile a Monte o a valle delle proteine di interesse) generalmente non importa . Infatti utilizzando FRB e FKBP come proteine modello, è stato dimostrato che tutte le quattro possibili iterazioni (entrambi i frammenti alla N-termini, entrambi alla C-termini, uno al N-terminale e l’altro C-terminale e viceversa) rendimento comparabile biotinylation9. Disegnare primers per amplificare ORFs delle due proteine di interesse per il clonaggio in plasmidi Spalato-BioID. Prestare attenzione che i fotogrammi di traduzione sono gli stessi come i frammenti di BirA. Se usando i plasmidi descritti nella Figura 2, è possibile utilizzare gli enzimi di restrizione PmeI e PacI per costruire la fusione CBirA * e gli enzimi ClaI e MluI per la fusione di NBirA *.Nota: I plasmidi rappresentati nella Figura 2 portano un elemento di tet-sensible a reagire di bi-direzionale affiancato da siti di ricombinazione di F3/FRT. Questo consente la co-espressione regolata all’incirca sullo stesso livello delle due proteine di fusione dal plasmide stesso10e la possibilità di costruire rapidamente linee cellulari stabili di cambio cassetta ricombinazione-mediata (RMCE). In questi plasmidi, NBirA * ha un tag di myc mentre CBirA * ha un tag di bandiera. ORFs naturalmente può anche essere clonate singoli plasmidi con promotori costitutivi.Passaggio critico: Durante il test di due proteine interagenti, si consiglia di confrontare fusa alla proteina 1 combinata con fuso a proteina 2 CBirA * NBirA * e NBirA * fusa alla proteina 2 combinata con CBirA * fusa alla proteina 1. Infatti, è frequentemente osservato che un’iterazione funziona meglio di altro. 2. clonazione ORFs dei geni di interesse nel plasmide Split-BioID Nota: In questo esempio, vengono considerate due proteine che possono essere contrassegnate al N-terminale. Quattro condizioni saranno testate e confrontate alle cellule non trasfettate (tabella 1). Reazione a catena della polimerasi (PCR) consente di amplificare ORFs delle due proteine da testare con i primer appropriati. Disegnare primers che introducono il ClaI e MluI siti di restrizione per le proteine di fusione NBirA * e il PacI e PmeI siti per le proteine di fusione di CBirA *.Nota: La PCR può essere eseguita con tutte le attività commerciali, preferenzialmente, correzione bozze, DNA polimerasi. Seguire il protocollo standard da manuale e adattare la temperatura di fusione dei primer e la lunghezza del ORF per essere amplificati secondo le indicazioni del produttore. Subclone il primo ORF Digerire sia plasmide (circa 2 μg) e PCR-amplificato ORF1 (per essere fusa a NBirA *) con ClaI e MluI. Eseguire reazioni di digestione utilizzando 1 μL di ogni enzima, mescolato con il volume appropriato di tampone del DNA e la reazione in un volume totale di 20 μL in una provetta da 1,5 mL per 1 h a 37 ° C. Eseguire entrambi esempi di digestione su un gel del DNA dell’agarosi-TAE di 1%. Asportare le bande corrispondenti a plasmide digerito e ORF1 con un bisturi pulito e trasferimento in provette da 1,5 mL. Purificare entrambe le bande utilizzando un kit di estrazione del DNA standard. Lega i plasmidico digerito e ORF1 utilizzando reagenti standard. Se utilizzando il kit di legatura indicato nella Tabella materiali, lega i 100 ng di DNA contenente eccesso molare di tempo di tre-cinque inserire sopra del plasmide in un volume totale di 4,5 μL. Aggiungere 5 µ l di tampone di ligasi x T4 2 e 0,5 μL di T4 DNA ligasi dal kit di legatura. Eseguire la reazione di legatura in una provetta da 1,5 mL per 10 min a temperatura ambiente (TA). Trasformare in celle competenti standard DH-5 α Escherichia coli (preparate secondo il metodo11 di Inoue). Mix 3 μL della reazione di legatura con 50 μL di cellule competenti in un 1,5 mL tubo sul ghiaccio ed incubare per 30 min. trasferimento alle cellule di un calore bloccano insieme a 42 ° C per 30-45 s e poi incubare in ghiaccio per 2 min. aggiungere 250 μL di pre-riscaldata (37 ° C) Lisogenesi brodo (LB) medio e piastra 100 μL di cellule su una piastra di LB-agar contenente ampicillina pre-riscaldata (37 ° C). Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C. Il giorno successivo, è possibile scegliere quattro-sei colonie e li Incubare a 37 ° C, 180 giri/min, pernottamento in 3 mL di terreno LB contenente 100 μg⋅mL-1 ampicillina in una provetta da 15 mL. Isolare i plasmidi dalle colonie raccolte utilizzando un kit di DNA MiniPrep standard. Verificare la correttezza dei plasmidi di Sanger sequenziamento utilizzando il primer reverse Cassette 2 (tabella 2). Una volta che è stato identificato un plasmide contenente il primo ORF, subclone secondo ORF in tale plasmide seguendo la stessa procedura come passo 2.2 ma usando gli enzimi PmeI e PacI. Sequenza i plasmidi risultanti utilizzando il primer reverse Cassette 1 (tabella 2). 3. test delle proteine di fusione Nota: Le seguenti istruzioni sono per il duplice espressione inducibile plasmidi (Figura 2) e HeLa-11ht cellule, una linea di cellule HeLa-CCL2 subclonal, che esprimono stabilmente la trascrizione inversa di tetraciclina-controllato attivatore rtTA-M2 e contenente un locus per RMCE12. Il mezzo di crescita per queste cellule è per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) contenente 10% siero bovino fetale privo di tetraciclina (FBS). Quando si utilizza un altro tipo di cellula, esatte condizioni di semina e crescita medio dovrà essere adattato. Trasfezione transiente Cellule di seme ad una concentrazione di 1 x 105 celle in 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti il giorno prima di transfezione e incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 in un’incubatrice di coltura cellulare. Il giorno della transfezione, rimuovere il supporto di ciascun pozzetto e sostituire con 2 mL di terreno nuovo. Preparare le quattro reazioni di transfezione secondo la tabella 1. Per ciascun pozzetto a transfect, aggiungere 6 µ g di polyethylenimine a 3 µ g di DNA plasmidico in una provetta sterile da 1,5 mL e riempire a 500 µ l con il mezzo di DMEM senza siero. Incubare ogni mix di transfezione per almeno 5 min a temperatura ambiente prima di aggiungere il saggio di goccia in ciascun pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2. Induzione e vicinanza-etichettatura Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e sostituirli con supplementato con biotina a 50 µM per stimolare biotinylation e doxiciclina a 200 ng⋅mL−1 per indurre l’espressione di proteine di fusione. Incubare le cellule per almeno 20 ore a 37 ° C, 5% CO2. Per rendere una soluzione stock di biotina, sciogliere Biotina presso 50 mg⋅mL-1 (corrisponde a ca. 200 mM) a 2 M di idrossido di ammonio. Una volta che è completamente dissolto, diluirlo a 50 mM a 500 mM Hepes, pH 7.4, quindi regolare il pH a 7.4 con HCl. aliquota e memorizzare la risultante 1.000 x soluzione di riserva a-20 ° C. Sciogliere la doxiciclina a mg⋅mL 10-1 in etanolo al 70% e conservare in una microprovetta tappo a vite a-20 ° C al buio. Preparazione del lysate delle cellule Lavare le cellule una volta con soluzione fisiologica 1 mL di freddo (4 ° C) in tampone fosfato (PBS). In ciascun pozzetto, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi). Raccogliere le cellule con una scrapper cella e trasferimento in provette da 1,5 mL. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire i surnatanti in provette di freschi e metterli su ghiaccio. Determinare la quantità di proteine con un’analisi di Bradford. Elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (PAGE) e Western blotting Preparare un gel di SDS-poliacrilammide. Per ciascuna deselezionata lisato, preparare un campione di pagina di 30 µ g (per un minimo di 15 µ g) della proteina in un totale di 30 µ l di tampone di caricamento SDS. Quindi caricare quantità uguali di ogni campione (20 µ l/pozzetto) su gel di SDS-poliacrilammide e procedere per elettroforesi. Dopo l’elettroforesi, trasferire le proteine frazionate ad una membrana di macchia bassa fluorescenza PVDF utilizzando qualsiasi protocollo standard.Nota: Per l’analisi della proteina biotinylation, un tempo di trasferimento di 10 min con il programma “alta MW” di un veloce trasferimento semi-secco Western blotting dispositivo di solito funziona bene. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana nel latte in polvere 5% in PBS per 30 minuti a TA. Incubare la membrana per 30 – 60 min a RT con fluorescente streptavidina coniugata 1:15,000 diluito in PBS contenente 2% BSA e 0,1% Tween-20. Lavare la membrana tre volte, ognuna per 10 min, con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e poi una volta di più con PBS. Scansione la membrana su un sistema di imaging scanner di fluorescenza.Tipica macchia occidentale Nota: A è mostrata in Figura 3. La procedura di cui sopra descrive una rilevazione basata su fluorescente ma una rilevazione basata su luminescenza utilizzando streptavidina accoppiata HRP funziona altrettanto bene. 4. Split-BioID per studi di proteomica Nota critica: Per l’analisi di spettrometria di massa finale, tutti i passaggi seguenti devono essere eseguite in condizioni prive di cheratina, tutti i materiali e i reagenti dovrebbero essere più possibile privo di cheratina. Trasfezione transiente Il giorno prima di transfezione, seme 10cm tre o quattro piastre per ogni condizione ad una concentrazione di 8 x 105 cellule di 10 mL per piastra e incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 in un’incubatrice di coltura cellulare. Il giorno successivo, è necessario preparare un mix di transfezione master per ogni condizione di transfezione: per tre piastre per patologia, 36 µ g di polyethylenimine e 18 µ g di DNA plasmidico disciolto in 900 µ l DMEM privo di siero. Incubare ogni mix master per almeno 5 minuti a TA. Nel frattempo, sostituire il mezzo di ogni piatto con mezzo fresco e quindi aggiungere 300 µ l della goccia di miscele di transfezione saggia per ogni piatto. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2. Induzione e vicinanza-etichettatura Il giorno dopo la trasfezione, trasferire le cellule ai piatti di 15 cm. Per ogni piatto, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con 7 mL di PBS, aggiungere 1,5 mL di una soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 5 min a RT. aggiungere 3,5 mL di terreno di coltura per risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare a un piatto di 15cm riempito con 20 mL di terreno di coltura completati con biotina a 50 µM per stimolare biotinylation e doxiciclina a 200 ng⋅mL− 1 (concentrazioni finali) di indurre l’espressione di proteine di fusione. Incubare le cellule per almeno 20 ore a 37 ° C, 5% CO2. Raccolta e conservazione delle cellule Lavare le cellule due volte con PBS, poi aggiungere 1,5 mL di PBS per ogni piatto e raccogliere le cellule con una scrapper. Trasferire le cellule prelevate, corrispondente a una condizione in una provetta da 15 mL e raccoglierle mediante centrifugazione a 1.200 x g, 5 min, 4 ° C. Rimuovere i surnatanti e snap congelare i pellet in azoto liquido, quindi conservare a 80 ° C fino a ulteriore elaborazione.Nota: In alternativa, le cellule possono anche staccate dal trypsinization, raccolte in terreno di coltura, trasferite in una provetta da 15 mL e lavare tre volte con PBS prima del congelamento. Preparazione dei lisati cellulari Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di tampone di lisi (50mm Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 millimetro DTT, 1 x inibitore della proteasi completa) a RT. Pass le cellule 10 – 20 volte (cinque-dieci colpi) attraverso un ago 25 G. Sonicare i campioni con un dispositivo di sonificazione.Nota: Con il dispositivo di sonificazione indicato in Tabella materiali, il seguente programma può essere utilizzato: quattro cicli ad alta intensità, 30 s per ciclo in un freddo (4 ° C) bagno d’acqua. Qualsiasi altro dispositivo di sonificazione è adatto ma parametri potrebbe essere necessario essere regolata di conseguenza. Aggiungi X-100 Triton a recuperato sonicato lisato di raggiungere una concentrazione finale di 2% (in genere, aggiungere 100 μL di 20% Triton X-100 a 900 μL sonicato lysate delle cellule) e poi 2,3 mL 50 mm Tris, pH = 7,4 per 1 mL di lisato per regolare la concentrazione di NaCl a 150 mM prima b obbligatoriodel ai branelli di streptavidina-accoppiato.Nota critica: Più alte concentrazioni di sale spesso provocano molto meno efficiente associazione ai talloni. Distribuire i lisati regolati in provette da 1,5 mL (ca. 1,1 mL in tre tubi) e li Centrifugare a 16.000 x g, 10 min, 4 ° C. Trasferire i surnatanti (ca. 3,2 mL) in una provetta da 15 mL e tenere 50 – 100 μL come materiale di INPUT. Misurare la concentrazione di ciascun campione con un saggio di Bradford e utilizzare l’equivalente del contenuto proteico 3 a 3,5 mg per il pulldown streptavidina. Streptavidina pulldownNota: Una panoramica della procedura pulldown è mostrata in Figura 4. È quasi identico al protocollo originale pubblicato da Roux e colleghi2. La prima volta che viene eseguita il pulldown, campioni di flusso attraverso e lavare 1 – 4 possono essere messo da parte per l’analisi Western blot garantire la procedura ha funzionata correttamente (Figura 5). Per ogni condizione, è necessario trasferire 200 μL della sospensione di microsfere magnetiche streptavidina-accoppiato a una provetta da 1,5 mL. Posizionare i tubi su un rack magnetico, attendere fino a quando le perline bastone al lato dei tubi (ca. 1 minuto) e rimuovere il buffer di memoria. Lavare le perle mescolando delicatamente con 1 mL di tampone di equilibrazione (Tris 50 mM a pH 7 – 4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 e 1 millimetro DTT). Spedire le perline equilibrate in pari quantità del numero necessario di tubi (solitamente quando si inizia con 3 – 3,5 mg di proteina contenuto, che i lisati da ogni condizione possono essere spediti in due-quattro provette da 1,5 mL) e posto indietro sulla griglia magnetica. Rimuovere il buffer di equilibrazione e Risospendere ciascun set di perline con uguali quantità dei corrispondente lisati cellulari dal punto 4.4.7. Incubare per una notte a 4 ° C su una ruota in movimento. Il giorno successivo, posizionare le provette da 1,5 mL su un rack magnetico, attendere che le perline bastone al lato dei tubi e trasferire i surnatanti etichettato come flusso attraverso un tubo da 15 mL.Nota: da questo momento in poi, tutti i passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente a meno che non diversamente indicato. Risospendere le sfere in ogni provetta con 200 μL di tampone di lavaggio 1 (2% SDS in acqua) e combinare ogni set di perline sedimento corrispondente a una condizione in provette da 1,5 mL. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 1. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 2 (50 millimetri HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 e 0.1% Na-desossicolato). Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 3 (10 mM Tris-HCl pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 e 0,5% Na-desossicolato). Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 4 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1% NP-40). Per assicurarsi che il tampone di lavaggio viene completamente rimosso dopo l’ultimo passaggio di lavaggio, rimuovere la maggior parte del surnatante e poi girare giù i campioni. Rimetterle sul rack magnetico, attendere che le perline bastone al lato dei tubi e quindi rimuovere il buffer rimanente. Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione (Tris 10 mM pH 7.4, 2% SDS e 5% β-mercaptoetanolo 2 mM biotina) ai talloni. Incubare a 98 ° C per 15 minuti, quindi rimuovere immediatamente le perle su una griglia magnetica. Trasferire il campione eluito per una nuova provetta e conservare a-20 ° C fino a ulteriore elaborazione. SDS-PAGE e Western blottingNota: Prima dell’analisi di spettrometria di massa, si consiglia di valutare il successo della biotinilazione e pulldown mediante SDS-PAGE e Western blot. Se non si osserva nessun modello di biotinilazione, si può considerare che dox o biotina non è stato aggiunto al medium o che una delle due soluzioni è compromessa. Per ogni esempio di input, è necessario preparare un campione di pagina mescolando uguali quantità di campione della proteina con il volume appropriato di tampone di caricamento SDS x 3 in un totale di 28 μL. Preparare i campioni pagina 5 µ l di ciascun campione di eluizione con 2,5 µ l di tampone di caricamento SDS x 3. Caricare i campioni (25 µ l/pozzetto per ingressi, 7 µ l/pozzetto per campioni di eluizione) su un gel di SDS-poliacrilammide. Procedere per elettroforesi e Western blotting come descritto nella sezione 3.4. Se eseguendo il pulldown per la prima volta, preparare pagina campioni per ciascuna fase del pulldown (Input, flusso attraverso, eluizione 1 – 4, Wash) mescolando 20 µ l di ciascun campione (Input, flusso attraverso, lavaggio 1 – 4) con 10 µ l di tampone di caricamento SDS o 5 µ l (eluizione) con 2,5 µ l di 3: 3x x S DS-caricamento del buffer e procedere come da punto 4.6.4 (Figura 5). SDS-PAGE per analisi MSNota: Per minimizzare la contaminazione potenziale di cheratina, gel prefabbricati e buffer di caricamento del campione commerciale possono essere utilizzati. Aggiungere 6,25 μL di tampone di campione 4 x a 18,75 μL di ciascun campione di eluizione ed eseguire gli esempi su un gel di SDS 4 – 20% prefabbricati, fino a quando non migrano 2 – 3 cm nel gel. Macchia il gel con G250 blu brillante di Coomassie colloidale macchiatura13 in una capsula Petri 15 cm. Utilizzare un bisturi pulito per asportare l’intere corsie per ogni campione, escluse la band di streptavidina (in esecuzione a ca. 17 kDa, Figura 6) e trasferire le bande asportate per provette da 1,5 mL. Invia questi campioni per un impianto di proteomica per ulteriori analisi.Nota: MS tipici risultati possono essere visto in riferimento 9 (Figura 3 e Figura 7e tabelle supplementari). L’intero set di dati sono disponibili sul repository di orgoglio (numero di accessione PXD005005).