ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

メモ: メソッドの概要については、図 1に表示されます。 1. クローン作成戦略の計画 テストする 2 つの推定の相互作用の蛋白質を選択します。注: 2 つの蛋白質の各は分割 BioID フラグメントが 1 つに融合する、: NBirA * または CBirA *。ネガティブ コントロールとして CBirA * 融合蛋白質を持つ NBirA * 緑色蛍光タンパク質融合テストされます (NBirA *-GFP)。同種 CBirA * 融合なしまたは無関係な蛋白質に溶ける CBirA * との組み合わせで、付加的な制御として NBirA * 融合だけでは、テスト可能性があります。CBirA * を使用しないことをお勧め-それはネガティブ コントロールとして GFP 一貫して任意 NBirA * 融合タンパク質9に結合されたとき主要な背景につながることが示されました。この観測の原因 CBirA * の発現レベルがあります-GFP、任意他 CBirA * の融合蛋白質我々 はこれまでのところ、使用している NBirA のフラグメントと重要な再結合する可能性がありますよりもはるかに高い。 2 つのタンパク質を選んだら、文学かどうか両方既に正常にタグ付けされている機能の研究 (例えばとして GFP タグ融合タンパク質) を見つけることを確認してください。 このような研究が存在する場合 (N- または C 末端で) タグの位置に注意してくださいし、分割 BioID フラグメントの興味の蛋白質にタグを同じ方向を使用します。 このような研究が存在しない場合、両蛋白質のためのコーディング計画構造はタグ付きの N 末端と C 領域でと (たとえば、WT タンパク質用消耗したセル行のレスキュー実験) の融合蛋白質の機能をテストするアッセイを計画します。注:図 2で説明したプラスミド長く柔軟なリンカーがエンコードを使用して 2 つの融合蛋白質を対にする場合融合蛋白質 (BirA * フラグメントの融合上流または下流に興味の蛋白質) の向き一般に問題ではないです。.確かに FRB と FKBP モデル蛋白質として、それが示された、すべて可能なイテレーションが 4 (N テルミニ C テルミニ N 末端と C 末端で 1 つの両方の両方の断片と逆) 匹敵するビオチン化9をもたらします。 分割 BioID プラスミドにクローニングに興味の 2 つの蛋白質の Orf を増幅するプライマーを設計します。翻訳フレームは、・ ビラのフラグメントと同じ注意を払います。図 2で説明したプラスミドを使用している場合は、CBirA * の融合と NBirA の融合酵素 ClaI および MluI を構築する制限酵素 PmeI とパーチを使用します。注:図 2にプラスミド F3/FRT 再結合サイトが並ぶ双方向テト応答要素を運ぶ。これは、同じプラスミド10組換えを介したカセット交換 (RMCE) による安定したセルラインを急速に構築する可能性からの両方の融合蛋白質のほぼ同じレベル規制共発現をことができます。これらのプラスミド NBirA * は、myc タグ CBirA * フラグの札があるとき。Orf は、もちろんは構成のプロモーターと個々 のプラスミドの複製もことができます。重要なステップ:NBirA * CBirA * 2、蛋白質に溶けると結合蛋白質 1 に溶けるを比較する勧めします 2 つの相互作用の蛋白質をテストするとき、NBirA * CBirA * 1 蛋白質に溶けると結合蛋白質 2 に溶けます。確かに、イテレーションは 1 つが他よりよく動作することはよく見られます。 2 分割 BioID プラスミドへの興味の遺伝子の Orf のクローニング 注: この例では、N 末端タグすることができます 2 つの蛋白質と見なされます。4 つの条件は、テストし、非 transfected セル (表 1) に比較されます。 ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して、適切なプライマーでテストする 2 つのタンパク質の Orf を増幅します。CBirA * の融合蛋白質のパーチと PmeI サイト NBirA * 融合蛋白質のため ClaI および MluI 制限のサイトを紹介するプライマーを設計します。注: PCR 可能任意の商業的に優先的に校正、DNA ポリメラーゼです。ハンドブックから標準的なプロトコルに従うし、プライマーの溶ける温度と製造元のガイドラインに従って増幅される ORF の長さに適応。 最初の ORF を subclone します。 プラスミド (約 2 μ g) と ClaI と MluI (NBirA * に融合される) を PCR 増幅 ORF1 を消化します。適切な量の総量が 37 ° C で 1 時間 1.5 mL チューブで 20 μ L の DNA と反応バッファーと混合、各酵素の 1 μ L を使用して消化反応を実行します。 1% のアガロース TAE DNA ゲルの両方消化サンプルを実行します。きれいなメスと 1.5 mL チューブへの転送消化プラスミッドおよび ORF1 に対応するバンドを切除します。 標準的な DNA 抽出キットを使用して両方のバンドを浄化します。 消化されたプラスミッドおよび ORF1 を縛る標準試薬を用いるします。 ライゲーション キットを使用して材料の表に示されている場合、結紮 100 ng の DNA を含む 3 〜 5 時間モル過剰 4.5 μ L の総ボリュームでプラスミドに挿入します。ライゲーション キットから 2 x T4 リガーゼ バッファーの 5 μ L と T4 DNA リガーゼの 0.5 μ L を追加します。部屋の温度 (RT) で 10 分の 1.5 mL チューブの ligation の反作用を実行します。 (井上の方法11によると準備) 標準の DH 5 αエシェリヒア属大腸菌の有能なセルに変換します。 1.5 mL の有能なセルの 50 μ L の ligation の反作用のミックス 3 μ L 氷の上管および転送熱細胞ブロック 30 45 s 42 ° C までのセットとに予め温めておいた (37 ° C) の 2 分を追加 250 μ L の氷の上に戻ってインキュベーションして 30 分間インキュベートホストゲノム スープ (LB) 中小企業プレート 100 μ L に予め温めておいた (37 ° C) アンピシリン含有 LB 寒天培地プレート上のセルの。37 ° C で一晩細胞をインキュベートします。 次の日に 4 ~ 6 のコロニーを拾うと 37 ° C, 180 rpm でそれらを孵化させなさい、15 mL チューブに 100 μg⋅mL-1アンピシリンを含む LB 培地 3 mL に一晩します。 標準的な DNA の MiniPrep キットを使用して選ばれた植民地からプラスミドを分離します。 サンガー カセット 2 逆プライマー (表 2) を用いたシーケンスによってプラスミドの正しさを確認します。 最初の ORF を含んでいるプラスミッドを特定したら、次の 2.2 の手順と同じ手順が、PmeI、パーチの酵素を使用してそのプラスミドで 2 番目の ORF を subclone します。 カセット 1 逆プライマー (表 2) を使用して生成されたプラスミドをシーケンスします。 3. 融合蛋白質のテスト 注: 次の手順は、デュアル誘導発現プラスミド (図 2) と HeLa 11ht セル、subclonal CCL2 HeLa 細胞株、逆テトラサイクリン制御転写活性化因子の情報を頼むこと M2 を安定に発現するを含む、RMCE12の軌跡。これらの細胞の成長媒体はダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% ウシ テトラサイクリン無料胎児血清 (FBS) を含みます。別のセルのタイプを使用する正確な播種条件と成長媒体は適応する必要があります。 トランスフェクション 種子 1 x 10 の5の濃度で細胞は細胞のトランスフェクション前日 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL と 37 ° C、5% CO2細胞文化のインキュベーターで一晩でセルを孵化させなさい。 トランスフェクションの日、各井戸の中を削除し、新鮮な培地 2 mL に置き換えます。 表 1に従って 4 つのトランスフェクション反応を準備します。使っても、ポリエチレンイミンの 6 μ g を 1.5 mL 滅菌チューブと血清なし DMEM 培地で 500 μ L に塗りつぶしのプラスミッド DNA の 3 μ g に追加します。 賢明なドロップを各ウェルに追加する前に室温で少なくとも 5 分ごとのトランスフェクション ミックスを孵化させなさい。一晩で 37 ° C、5% CO2セルを孵化させなさい。 誘導と近接ラベリング トランスフェクション後、日はメディアを削除し、ビオチン化を刺激するために 50 μ M でビオチンと融合タンパク質の発現を誘導するために 200 の ng⋅mL−1でドキシサイクリン培に置き換えます。37 ° C、5% CO2で少なくとも 20 時間のセルを孵化させなさい。 ビオチンの原液をするためには、50 の mg⋅mL-1でビオチンを解散 ( caに対応します。 200 mM) 2 M 水酸化アンモニウム。それを完全に溶解、一度 50 mm 500 mM Hepes、pH 7.4 では、希釈し、塩酸因数で 7.4 に pH を調整して結果 1,000 x 貯蔵液-20 ° C で保存70% エタノールで 10 mg⋅mL-1と暗闇の中での-20 ° C でスクリュー キャップ チューブ内のストアでドキシサイクリンを溶解します。 細胞ライセートの調製 一度風邪 (4 ° C) の 1 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とセルを洗います。 各ウェルに 100 μ L の換散バッファー (50 mM Tris pH 7.4 では、150 mM の NaCl、2 ミリメートルの EDTA、0.5 %np-40 0.5 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤) を追加します。 セル スクラッパーと 1.5 mL チューブへの転送セルを収穫します。 14,000 x g細胞の残骸を削除する 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心します。 培養上清を新しいチューブに転送し、氷の上に配置します。 ブラッドフォードの試金とタンパク質の量を定めます。 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) と西部にしみが付くこと SDS ポリアクリルアミドのゲルを準備します。 各クリア ライセート、SDS の読み込みバッファーの 30 μ L の合計で 30 μ g (最小 15 μ g) 蛋白質のページのサンプルを準備します。SDS ポリアクリルアミドのゲルの各サンプル (20 μ L/ウェル) の同量をロードし、電気泳動に進みます。 電気泳動後に、任意の標準的なプロトコルを使用して、低蛍光 PVDF のしみの膜に分別された蛋白質を転送します。メモ: ビオチン化タンパク質を解析、高速「高 MW」プログラムで 10 分転送時間セミドライ デバイスを通常ウエスタンブロットがうまく転送します。 転送後、ブロック 5% 室温 30 分間 PBS で乾燥したミルクの膜 2 %bsa および 0.1% を含む PBS で蛍光ストレプトアビジン共役希釈 1:15,000 と RT で 30-60 分のための膜をインキュベート トゥイーン 20。 0.1% Tween 20、その後 PBS でより多くを含む PBS で 3 回、各 10 分間、膜を洗浄します。 蛍光スキャナーのイメージング システムの膜をスキャンします。注: A 典型的な西部のしみは、図 3に表示されます。上記の手順は、蛍光検出を説明しますが、HRP 結合ストレプトアビジンを使用して発光検出が均等にうまきます。 4. 分割-BioID プロテオミクス研究 重要なメモ:すべてのケラチン無料条件で実行する次の手順は、最終の質量分析のすべての材料および試薬として可能な限りケラチン無料はずです。 トランスフェクション トランスフェクション、前日プレートあたり 10 mL の 8 x 10 の5セルの濃度条件ごとに 3 〜 4 10 cm シードし、37 ° C、5% CO2細胞文化のインキュベーターで一晩でセルを孵化させなさい。 次の日、トランスフェクション条件ごとにマスター トランスフェクション ミックスを準備: 1 つの条件 3 つの板は、ポリエチレンイミン、36 μ g、18 μ g のプラスミド DNA は 900 μ L に溶解した無血清 DMEM。各マスターのミックス ルートで少なくとも 5 分間のインキュベートします。 一方で、それぞれの料理の中を新鮮な媒体に置き換えて、各プレートに賢明なトランスフェクション混合ドロップの 300 μ L を追加します。 一晩で 37 ° C、5% CO2セルを孵化させなさい。 誘導と近接ラベリング トランスフェクション後、日は、15 cm の皿にセルを転送します。各料理は、メディアを取り出して、7 ml の PBS のセルを洗浄して、トリプシン EDTA 溶液 1.5 mL を追加、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を 20 ml 成長培地の 15 cm 皿に転送する成長媒体のルート追加 3.5 mL で 5 分間インキュベートビオチン化を刺激するために 50 μ M でビオチンとドキシサイクリン 200 ng⋅mL− 1 (最終濃度) 融合タンパク質の発現を誘導することで補った。 37 ° C、5% CO2で少なくとも 20 時間のセルを孵化させなさい。 細胞の収穫・ PBS で 2 回細胞を洗浄し、各プレートに 1.5 mL の PBS を追加、スクラッパーとセルを収穫します。 15 mL チューブに 1 つの条件に対応する収穫のセルを転送し、1,200 x g、5 分、4 ° C での遠心分離によってそれらを収穫 培養上清を外し、スナップは、さらに処理まで液体窒素 80 ° c 店でペレットを凍結します。注: また、セルも trypsinization によって取り外される、成長培地で収穫された、15 mL チューブに転送でき凍結前に PBS で 3 時間を洗浄します。 セル lysates の準備 再懸濁します換散バッファー (50 mM トリス pH 7.4 では、500 mM の NaCl、0.4 %sds、5 ミリメートルの EDTA、1 mM DTT、1 完全なプロテアーゼ阻害剤) RT。 峠での 1 mL の細胞ペレット セル 10-20 倍 (5 〜 10 ストローク) 25 G 注射針で。 サンプル音声化デバイスと超音波照射します。注: 可聴デバイス材料の表に示されている、次のプログラム使用できます: 高強度、30 で 4 サイクル (4 ° C) 冷サイクル毎秒水浴。他の音声化デバイスが適していますが、パラメーターがそれに応じて調整する必要があります。 回復したにトリトン X-100 が 2% の最終濃度に到達するライセート超音波処理を追加 (通常は、100 μ L を追加 20 0 μ L にトリトン X-100 は細胞ライセートを超音波処理) と 50 mm、トリス、2.3 mL pH = b の前に 150 mm NaCl 濃度を調整する溶解液の 1 mL あたり 7.4ストレプトアビジン結合ビーズに inding。重要なメモ:高い塩濃度は、ビーズにはるかに少ない効率的なバインディングではよくあります。 1.5 mL チューブの調整の lysates を配布 (ca3 つのチューブで 1.1 mL) 16,000 × g、10 分、4 ° c で遠心分離機のことと。 培養上清を転送 (ca. 3.2 mL) 15 mL チューブ、および入力材料として保つ 50-100 μ L に。 ブラッドフォードの試金の各サンプルの濃度を測定し、ストレプトアビジン プルダウン 3 〜 3.5 mg タンパク質含有量に相当します。 ストレプトアビジン プルダウン注: プルダウンの手順の概要については、図 4に表示されます。ルーと同僚2発行元のプロトコルとほぼ同じです。プルダウンを実行すると、最初に流れると洗浄 1-4 のサンプルが後回しにする西部のしみの分析のため正しく働いてプロシージャ (図 5)。 各条件について、ストレプトアビジン結合磁性体ビーズ懸濁液 200 μ L を 1.5 mL チューブに転送します。磁気ラックにチューブを置き、管の側に固執するビーズまで待つ (ca。 1 分) およびストレージ バッファーを削除します。 優しく平衡バッファー (50 mM Tris pH 7-4、150 mM NaCl、0.05% トリトン X-100 と 1 mM DTT) の 1 mL を混合することによってビーズを洗浄します。 磁気ラック背面チューブ (通常起動時 3-3.5 mg タンパク質のコンテンツ、各状態から溶解液を 2 ~ 4 1.5 mL チューブにディスパッチできます) および場所の必要な数の等しい量の平衡のビーズをディスパッチします。 平衡バッファーを削除し、ステップ 4.4.7 から対応するセル lysates の同量とビーズの各セットを再懸濁します。回転ホイールに 4 ° C で一晩インキュベートします。 次の日、磁気ラックに 1.5 mL チューブを置き、ビーズ、チューブの側に固執し、フローというレッテルを 15 mL チューブに培養上清を転送するを待ちます。注: これからのすべての手順を行った室温で別段 各管を洗浄バッファー 1 (水 2 %sds) 200 μ l でビードを再停止しなさい、1.5 mL チューブの 1 つの条件に対応する再懸濁のビーズの各セットを組み合わせます。 1 ml の洗浄バッファー 1 の回転ホイールに 8 分間 2 回ビーズを洗います。 1 mL の洗浄バッファー 2 回転ホイールに 8 分間 2 回ビーズを洗浄 (50 mM HEPES pH 7.4 では、1 mM EDTA、500 mM の NaCl、1% トリトン X-100, 0.1 %na デオキシ コール酸)。 1 mL の洗浄バッファー 3 回転ホイールに 8 分間 2 回ビーズを洗う (10 mM Tris pH 8、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.5 %np-40、および 0.5 %na デオキシ コール酸)。 1 mL の洗浄バッファー 4 回転ホイールに 8 分間 2 回ビーズを洗浄 (50 mM Tris pH 7.4 では、50 mM NaCl 0.1% NP 40)。 最後のステップを洗浄後、洗浄バッファーが完全に削除されていることを確認するには、上澄みの大部分を削除して後、スピンダウン サンプル。マグネッ トラックに戻ってそれらを置く、ビーズ チューブの側面に固執し、バッファーの残りを削除するを待ちます。 30 μ L の溶出バッファーを追加 (10 mM Tris pH 7.4 では、2 mM ビオチン、5% β-メルカプトエタノール、2 %sds) ビーズに。98 の ° C、15 分間インキュベートし、磁気ラックのビーズはすぐに削除します。 さらに処理まで溶出サンプルを新鮮なチューブ、-20 ° C でストアに転送します。 SDS のページおよび西部にしみが付くこと注: 質量分析の前に勧めしますビオチン化やプルダウンの成功を評価するために SDS-PAGE と西部のしみ。1 つはことを考慮可能性がありますビオチン化パターンが観測されない場合、dox またはビオチンが媒体に追加されませんでしたまたは株式の 2 つのソリューションのいずれかが侵害されました。 それぞれの入力サンプルを 28 μ L の合計で 3 x SDS の読み込みバッファーの適切なボリュームと蛋白質のサンプルの同じ量を混合することによってページのサンプルを準備します。3 x SDS の読み込みバッファーの 2.5 μ L で各溶出サンプルの 5 μ L を混合することによって、ページのサンプルを準備します。 SDS ポリアクリルアミドのゲルのサンプル (入力のため 25 μ L/ウェル、溶出サンプル 7 μ L/ウェル) をロードします。電気泳動、ウエスタンブロット セクション 3.4 で説明するように進みます。 初めてのプルダウンを行う場合準備ページ プルダウン (入力、流れ、洗浄 1-4 溶出) の各ステップのサンプル各サンプル (入力、流れ、洗浄 1-4) SDS 読み込みバッファーまたは 3 の 2.5 μ L、5 μ L (溶出) x 3 の 10 μ L の 20 μ L を混合することによって S xDS 読み込みバッファーし、4.6.4 (図 5) の手順に進みます。 MS 分析用 SDS ページ注: ケラチンの潜在的な汚染を最小限に抑えるプレキャスト ゲルと商業サンプル読み込みバッファー可能性があります使用。 各溶出サンプルの 18.75 μ L に 4 x サンプルバッファーの 6.25 μ L を追加し、ゲルに 2-3 cm を移行するまで、プレキャスト 4-20 %sds ゲルのサンプルを実行します。 13 15 cm のシャーレを染色コロイド Coomassie の鮮やかなブルー G250 とゲルを染色します。 (約 17 kDa、図 6で実行)、ストレプトアビジン バンドを除く、各サンプルの全体のレーンを切除し、摘出バンドを 1.5 mL チューブに転送するには、きれいなメスを使用します。 さらに分析のためのプロテオミクス施設にこれらのサンプルを送信します。注: 参照 9 (図 3および図 7、および補足テーブル) の典型的な MS の結果を見ることができます。プライド リポジトリ (加入番号 PXD005005) に全体のデータセットがあります。