Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Opmerking: Een overzicht van de methode wordt weergegeven in Figuur 1. 1. planning van de strategie van klonen Selecteer twee vermeende interacterende eiwitten te beproeven.Opmerking: Elk van de twee eiwitten zal worden gesmolten naar een fragment van de split-BioID: NBirA * of CBirA *. Als een negatieve controle, zal de CBirA * fusion eiwitten worden getest met NBirA * gesmolten aan de groen fluorescente proteïne (NBirA *-GFP). Als een extra controle, kunnen de NBirA *-fusies alleen, zonder cognaat CBirA * fusion of in combinatie met een CBirA * gesmolten aan een ongerelateerde proteïne worden getest. Het is raadzaam niet te gebruiken CBirA *-GFP als een negatieve controle als het werd aangetoond dat het consequent leiden tot grote achtergrond wanneer samengevoegd tot een NBirA * fusion eiwit9. De oorzaak van deze observatie mogelijk het niveau van de expressie van de CBirA *-GFP, veel hoger dan elke andere CBirA * fusion eiwitten hebben we tot nu toe gebruikt die tot aanzienlijke hier met het NBirA-fragment leiden kunnen. Als twee eiwitten zijn geselecteerd, controleert u de literatuur te vinden of beide zijn reeds met succes gelabeld in functionele studies (bijvoorbeeld als een GFP-gelabeld fusieproteïne). Als dergelijke studies bestaat, noteert u de positie van de tag (op de N – of C-terminus) en dezelfde afdrukstand gebruiken om tag van de proteïnen van belang met de split-BioID fragmenten. Als geen dergelijke studie bestaat, plan constructies coderen voor beide eiwitten op de N – en C-terminus gelabeld en plan een test om te testen van de functionaliteit van de fusie-eiwitten (bijvoorbeeld een experiment van de redding in een cellijn uitgeput voor de WT-proteïne).Opmerking: Wanneer twee fusion eiwitten met behulp van de plasmiden beschreven in Figuur 2 die lange flexibele linkers coderen in paren rangschikken, de oriëntatie van de fusie-eiwitten (BirA * fragmenten gesmolten stroomopwaarts of stroomafwaarts van de proteïnen van belang) in het algemeen maakt niet uit . Inderdaad met behulp van FRB en FKBP als model eiwitten, werd aangetoond dat alle vier mogelijke iteraties (beide fragmenten op de N-termini, zowel op de C-termini, één voor één de N-terminus en anderzijds de C-terminus, en vice versa) opbrengst van vergelijkbare biotinylation9. Inleidingen aan het versterken van de ORFs van de twee eiwitten van belang voor het klonen in de split-BioID-plasmiden ontwerpen. Aandacht dat de vertaling frames hetzelfde als de BirA-fragmenten zijn. Als met de plasmiden beschreven in Figuur 2, gebruikt u de restrictie-enzymen PmeI en PacI voor de bouw van de CBirA-fusie en de enzymen ClaI en MluI voor de NBirA-fusie.Opmerking: De plasmiden afgebeeld in Figuur 2 voeren een bi-directionele tet-responsief element geflankeerd door F3/FRT recombinatie sites. Hierdoor is de gereglementeerde co expressie op ongeveer hetzelfde niveau van beide fusie-eiwitten uit de dezelfde plasmide10, en de mogelijkheid om snel het bouwen van stabiele cellijnen door recombinatie-gemedieerde cassette exchange (RMCE). In deze plasmiden heeft NBirA * een myc tag terwijl CBirA * een vlag-tag. De ORFs kunnen natuurlijk ook worden gekloond op individuele plasmiden met constitutieve initiatiefnemers.Kritieke stap: Bij het testen van twee interacterende eiwitten, wordt u geadviseerd te vergelijken NBirA * gesmolten aan proteïne 1 gecombineerd met CBirA * gesmolten aan proteïne 2 en NBirA * gesmolten aan proteïne 2 gecombineerd met CBirA * gesmolten aan proteïne 1. Inderdaad, is er vaak opgemerkt dat één iteratie beter dan de andere werkt. 2. het klonen van de ORFs van de genen van belang in het plasmide Split-BioID Opmerking: In dit voorbeeld worden twee proteïnen die kunnen worden gecodeerd in de N-terminus beschouwd. Vier voorwaarden zal worden getest en vergeleken met niet-transfected cellen (tabel 1). Polymerase-kettingreactie (PCR) gebruiken om te vergroten de ORFs van de twee eiwitten te beproeven met de juiste inleidingen. Inleidingen die invoering van de ClaI en MluI beperking sites voor de NBirA * fusie-eiwitten, en de PacI en PmeI voor de CBirA * fusion eiwitten te ontwerpen.Opmerking: De PCR kan worden uitgevoerd met enig commercieel, bij voorkeur proeflezen, polymerase van DNA. Volg het standaardprotocol van het handboek en aan te passen aan de smelttemperatuur van de inleidingen en de lengte van de ORF kan worden versterkt, volgens de richtlijnen van de fabrikant. De eerste ORF subclone Het verteren van zowel de plasmide (ongeveer 2 μg) en de PCR-versterkte ORF1 (te worden gesmolten tot NBirA *) met ClaI en MluI. Uitvoeren van spijsvertering reacties met behulp van 1 μL van elk enzym, gemengd met het juiste volume van DNA en reactie buffer in een totaal volume van 20 μL in een tube 1,5 mL gedurende 1 uur bij 37 ° C. Beide voorbeelden van spijsvertering uitvoeren op een 1% agarose-TAE DNA-gel. Accijnzen de bands verteerd plasmide en ORF1 correspondeert met een schone scalpel en transfer naar 1,5 mL tubes. Beide bands met een standaard kit voor de extractie van DNA te zuiveren. Afbinden verteerd plasmide en ORF1 gebruikmaken van standaard reagentia. Wanneer met behulp van de afbinding kit in Tabel van materialen aangegeven, afbinden 100 ng DNA bevatten drie tot vijf keer molaire overmaat invoegen over plasmide in een totaal volume van 4.5 μL. Voeg 5 μL van 2 x T4 ligase buffer en 0,5 μL van T4 DNA ligase uit de afbinding kit. De afbinding reactie in een tube 1,5 mL gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) uitvoeren. Transformeren in standaard DH-5α E. coli bevoegde cellen (bereid volgens Inoue de methode11). Mix 3 μL van de afbinding reactie met 50 μl van bevoegde cellen in een 1,5 mL tube op ijs en incubeer gedurende 30 min. overdracht de cellen aan een hitte ingesteld op 42 ° C gedurende 30-45 s blokkeren en vervolgens uit te broeden terug op het ijs voor 2 min. 250 toevoegen μL van voorverwarmde (37 ° C) lysogenie Bouillon (LB) medium en plaat 100 μl van de cellen in een voorverwarmde (37 ° C) ampicilline-bevattende LB-agarplaat. Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C. Op de volgende dag, ophalen vier tot zes kolonies en hen Incubeer bij 37 ° C, 180 rpm, overnachting in 3 mL LB opslagmedium met 100 μg⋅mL-1 ampicilline in een tube van 15 mL. Isoleren van de plasmiden uit de geplukte kolonies met behulp van een standaard DNA MiniPrep kit. De juistheid van de plasmiden door Sanger sequencing met behulp van de Cassette 2 omgekeerde primer (tabel 2). Zodra een plasmide die met de eerste ORF is geconstateerd, subclone het tweede ORF in dat plasmide volgen de zelfde stappen zoals stap 2.2 maar met behulp van de PmeI en PacI enzymen. Het volgnummer van de resulterende plasmiden met behulp van de Cassette 1 omgekeerde primer (tabel 2). 3. het testen van de fusie-eiwitten Opmerking: De volgende instructies gelden voor de dubbele afleidbare expressie plasmiden (Figuur 2) en HeLa-11ht cellen, een subclonal HeLa-CCL2-cellijn, stabiel uiten de omgekeerde transcriptie van het tetracycline-gecontroleerde activator rtTA-M2 en met een Locus voor RMCE12. Het groeimedium voor deze cellen is de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% tetracycline-vrije foetale runderserum (FBS). Wanneer u een ander celtype, zal exacte seeding voorwaarden en groeimedium moeten worden aangepast. Voorbijgaande Transfectie Zaad-cellen bij een concentratie van 1 x 105 cellen in 2 mL per putje van de plaat van een zes-well eergisteren transfectie en Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator. Op de dag van de transfectie, verwijder het medium van elk putje en vervang met 2 mL verse voedingsbodem. De vier reacties van de transfectie volgens tabel 1voor te bereiden. Toevoegen voor elk putje te transfect, 6 µg polyethylenimine tot 3 µg plasmide DNA in een steriele buis 1,5 mL en vul tot 500 µL met DMEM medium zonder serum. Incubeer elke transfectie mix voor ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur voordat u drop wise toevoegt aan elk putje. Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C, 5% CO2. Inductie en nabijheid-labeling De dag na de transfectie, verwijder het medium en vervang met medium aangevuld met biotine op 50 µM ter stimulering van biotinylation en doxycycline bij 200 ng⋅mL−1 voor het opwekken van de expressie van de fusie-eiwitten. Incubeer de cellen gedurende ten minste 20 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Om een stockoplossing van biotine, ontbinden Biotine op 50 mg⋅mL-1 (overeen met ca. 200 mM) in 2 M ammoniak hydroxide. Zodra het volledig is opgelost, Verdun het tot 50 mM 500 mM Hepes, pH 7.4, dan breng de pH op 7.4 met HCl. Aliquot en opslaan van de resulterende 1.000 x stockoplossing bij-20 ° C. Ontbinden doxycycline op 10 mg⋅mL-1 in 70% ethanol en winkel in een schroefdop microtube bij-20 ° C in het donker. Cel lysate voorbereiding Wassen van de cellen een keer met 1 mL koud (4 ° C)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 100 µL van lysis buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA 0.5% NP-40, 0.5 mM DTT en proteaseinhibitors) toe aan elk putje. Het oogsten van de cellen met een cel scrapper en transfer naar 1,5 mL tubes. Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot cel puin te verwijderen. Het supernatant overbrengen in verse buizen en plaats op ijs. Bepalen eiwit bedragen met een analyse van Bradford. SDS-polyacrylamide gelelektroforese (pagina) en het westelijke bevlekken Voorbereiden van een SDS-polyacrylamide-gel. Voor elk gewist lysate, een voorbeeld van de pagina van 30 µg (minimum 15 µg) eiwit in een totaal van 30 µL van SDS-laden buffer voor te bereiden. Dan laden gelijke hoeveelheden van elk monster (20 µL per putje) op de SDS-polyacrylamide-gel en overgaan tot elektroforese. Na elektroforese, door de gefractioneerde eiwitten te overbrengen in een lage fluorescentie PVDF vlek membraan met behulp van een standaardprotocol.Opmerking: Voor het analyseren van eiwit-biotinylation, een transfertijd van 10 min met de “hoge MW”-programma van een snelle overdracht semi-droge westelijke bevlekken apparaat meestal goed werkt. Na de overdracht, blokkeren de membraan in 5% droge melk in PBS voor 30 min op RT. Incubeer de membraan voor 30-60 min op RT met fluorescerende streptavidine geconjugeerde verdunde 1:15,000 in PBS met 2% BSA en 0,1% Tween-20. Spoel het membraan driemaal, elk voor 10 min, met PBS met 0,1% Tween-20, en klik vervolgens eenmaal meer met PBS. Scan het membraan op een fluorescentie scanner imaging systeem.Opmerking: een typische westelijke vlek is op Figuur 3weergegeven. De bovenstaande procedure beschrijft een TL gebaseerde detectie maar een luminescentie gebaseerde detectie met behulp van HRP-coupled daar werkt even goed. 4. Split-BioID voor Proteomics Studies Kritische noot: Voor massaspectrometrische uiteindelijk al de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in de keratine-vrij voorwaarden, alle materiaal en reagentia moeten als keratine-vrij mogelijk. Voorbijgaande Transfectie De dag voor transfectie, zaad van drie tot vier 10 cm platen voor elke voorwaarde in een concentratie tussen 8 x 105 cellen in 10 mL per plaat, en Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator. Op de volgende dag, bereiden een master transfectie mix voor elke voorwaarde transfectie: voor drie platen per voorwaarde, 36 µg voor polyethylenimine, en 18 µg plasmide DNA ontbonden in 900 µL serumvrij DMEM. Incubeer elke master mix voor minstens 5 min op RT. In de tussentijd, het vervangen van het medium voor elk gerecht met verse medium, en voegt u 300 µL van de transfectie mengsels drop verstandig om elke plaat. Incubeer de cellen ‘s nachts bij 37 ° C, 5% CO2. Inductie en nabijheid-labeling De dag na de transfectie, transfer de cellen tot 15 cm schotels. Voor elk gerecht, verwijderen van het medium, wassen van de cellen met 7 mL PBS, voeg 1,5 mL van een trypsine-EDTA-oplossing en incubeer gedurende 5 min op RT. Voeg 3,5 mL van groeimedium resuspendeer de cellen en het overbrengen van de celsuspensie naar een 15 cm schotel gevuld met 20 mL groeimedium aangevuld met biotine op 50 µM ter stimulering van biotinylation en doxycycline op 200 ng⋅mL−1 (eindconcentraties) voor het opwekken van de expressie van de fusie-eiwitten. Incubeer de cellen gedurende ten minste 20 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Oogsten en opslaan van de cellen Wassen van de cellen tweemaal met PBS, dan Voeg 1,5 mL PBS toe aan elke plaat en oogsten van de cellen met een scrapper. Overdracht van de geoogste cellen dat overeenkomt met een voorwaarde voor een tube van 15 mL en oogst ze door centrifugeren op 1200 x g, 5 min, 4 ° C. Verwijder het supernatant en module bevriezen de pellets in vloeibare stikstof, dan winkel bij 80 ° C totdat zij worden verwerkt.Opmerking: Als alternatief, cellen kunnen ook worden losgekoppeld door trypsinebehandeling, geoogst in groeimedium, overgebracht naar een tube van 15 mL en drie keer met PBS gewassen vóór het invriezen. Voorbereiding van cel lysates De cel pellets in 1 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x volledige proteaseinhibitor) bij RT. Pass resuspendeer de cellen 10-20 keer (vijf tot tien strokes) door middel van een naald van 25 G. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters met een sonification-apparaat.Opmerking: Met het sonification apparaat aangegeven in Tabel van materialen, het volgende programma kan worden gebruikt: vier cycli bij hoge intensiteit, 30 s per cyclus in een koud (4 ° C) waterbad. Een ander sonification-apparaat is geschikt maar parameters zou moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Voeg Triton X-100 naar de herstelde sonicated lysate te bereiken van een definitieve concentratie van 2% (meestal, voeg 100 μl van 20% sonicated Triton X-100 tot 900 μL cel lysate), en vervolgens 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7.4 per 1 mL lysate aanpassen van de concentratie van de NaCl tot 150 mM voor b INDENDE aan streptavidine-coupled kralen.Kritische noot: Hogere concentraties van zout resulteren vaak in veel minder efficiënt binding met de kralen. Verspreiden van de aangepaste lysates in 1,5 mL buisjes (ca. 1.1 mL in drie buizen) en centrifugeer ze bij 16.000 x g, 10 min, 4 ° C. Overdracht van het supernatant (ca. 3,2 mL) aan een tube 15 mL, en houd 50-100 μl als INPUT materiaal. Meten van de concentratie van elk monster met een analyse van Bradford en gebruik het equivalent van 3 tot en met 3.5 mg eiwitgehalte voor de daar pulldown. Daar pulldownOpmerking: Een overzicht van de pulldown procedure wordt weergegeven in Figuur 4. Het is vrijwel identiek aan het oorspronkelijke protocol gepubliceerd door Roux en collega’s2. De eerste keer de pulldown wordt uitgevoerd, monsters van stroom door- en afwas 1 – 4 kunnen opzij worden gezet voor westelijke vlekkenanalyse om ervoor te zorgen de procedure naar behoren werkte (Figuur 5). Voor elke voorwaarde die, door 200 μL van daar-coupled magnetische kralen schorsing te overbrengen in een 1,5 mL-buis. Plaatsen van de buizen op een magnetische rek, wachten tot de kralen vasthouden aan de kant van de buizen (ca. 1 min) en verwijderen van de opslag-buffer. Het wassen van de kralen door zachtjes te vermengen met 1 mL van de evenwichtsinstelling buffer (50 mM Tris pH 7-4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 en 1 mM DTT). Verzending van de equilibrated kralen in gelijke hoeveelheid in het benodigde aantal buizen (gewoonlijk wanneer te beginnen met 3-3,5 mg eiwit inhoud, dat de lysates van elke voorwaarde kan worden verzonden in twee tot vier 1,5 mL buizen) en plaats terug op het magnetische rek. Verwijder de evenwichtsinstelling buffer en resuspendeer elke set van parels met gelijke hoeveelheden van de corresponderende cel lysates uit stap 4.4.7. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een roterend wiel. Op de volgende dag, de 1,5 mL buisjes plaatsen op een magnetische rek, wachten tot de kralen aan de kant van de buizen vasthouden en het supernatant overbrengen in een tube van 15 mL aangeduid als Flow door.Opmerking: voortaan alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Resuspendeer de kralen in elke buis met 200 μL van was buffer 1 (2% SDS in water), en elke set van geresuspendeerde kralen overeenkomt met één voorwaarde in 1,5 mL buizen combineren. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 1. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL 2-was buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 en 0,1% nb-deoxycholate). Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, en 0,5% NB-deoxycholate). Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 4 (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40). Om ervoor te zorgen dat de wash-buffer wordt volledig verwijderd nadat de laatste wassen stap, allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen en draai vervolgens naar beneden van de monsters. Zet ze terug op het magnetische rek, wachten tot de kralen aan de kant van de buizen vasthouden en verwijder vervolgens de resterende buffer. Voeg 30 l elutie buffer (10 mM Tris pH 7.4, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol en 2 mM Biotine) op de parels. Incubeer bij 98 ° C gedurende 15 minuten, waarna de kralen op een magnetische rek onmiddellijk te verwijderen. Overdracht van het eluted monster een verse buis en opslag bij-20 ° C totdat zij worden verwerkt. SDS-pagina en het westelijke bevlekkenOpmerking: Vóór de analyse van de Spectrometrie van de massa, het is aanbevolen om te beoordelen van het succes van de biotinylation en de pulldown door SDS-pagina en westelijke vlek. Indien geen biotinylation patroon wordt waargenomen men kan oordelen dat dox of Biotine is niet toegevoegd aan het medium of dat een van de twee voorraadoplossingen in het gedrang komt. Voor elke invoer monster, bereid u een voorbeeld van de pagina door het mengen van gelijke hoeveelheden eiwitSteekproef met het juiste volume voor 3 x SDS-laden buffer in totaal 28 μL. Bereid pagina monsters door het mengen van 5 µL van elk monster elutie met 2,5 µL van 3 x SDS-laden buffer. Laden van de monsters (25 µL per putje voor ingangen, 7 µL per putje voor elutie monsters) op een SDS-polyacrylamide-gel. Ga naar elektroforese en Western blotting zoals beschreven in sectie 3.4. Als de keuzelijst voor de eerste keer uitvoert, bereid pagina monsters voor elke stap van de pulldown (Input, stroom door, Wash 1 – 4: elutie) door het mengen van 20 µL van elk monster (Input, stroom door, Wash 1 – 4) met 10 µL van 3 x SDS-laden buffer of 5 µL (elutie) met 2,5 µL van 3 x S DS-laden buffer en ga op stap 4.6.4 (Figuur 5). SDS-pagina voor MS analyseOpmerking: Om te minimaliseren van potentiële keratine besmetting, geprefabriceerd gels en commerciële monster laden buffer kunnen worden gebruikt. 6,25 μL van 4 x monster buffer toevoegen aan 18,75 μL van elk monster elutie en draaien van de monsters op een 4-20% voorgegoten SDS-gel totdat ze 2 – 3 cm in de gel migreren. De gel met colloïdaal Coomassie briljant blauw G25013 in een petrischaal 15 cm kleuring vlekken. Gebruik een schone scalpel de hele rijstroken voor elk monster, met uitzondering van de streptavidine band (uitgevoerd op ca. 17 kDa, Figuur 6), accijnzen en het overbrengen van de verwijderde bands naar 1,5 mL tubes. Stuur deze monsters tot een proteomics facility voor verdere analyse.Opmerking: MS (normaal) resultaten kunnen worden gezien in de verwijzing 9 (Figuur 3 en Figuur 7, en aanvullende tabellen). De hele datasets zijn beschikbaar op de trots repository (toetreding nummer PXD005005).