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Genetics

Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

Published: March 05, 2018
doi:
10.3791/57413
,
1Department of Pharmacology,University of Minnesota

Summary

El objetivo de este protocolo es cuantificar la reparación de reticulaciones de ADN-proteína definido en ADN plásmido. Plásmidos lesionados son transfectados en líneas celulares mamíferos receptores y bajo peso molecular cosechada en múltiples puntos de tiempo después la transfección. Cinética de reparación del ADN se cuantificó usando extensión primer filamento específico seguido por qPCR.

Abstract

El propósito de este método es proporcionar una técnica flexible, rápida y cuantitativa para estudiar la cinética de reparación de ADN-proteína reticulación (DPC) en líneas celulares mamíferos. En lugar de globalmente ensayando retiro de retiro de DPC cromosómica inducida por xenobióticos o espontáneo, este ensayo examina la reparación de una lesión homogénea, químicamente definida introducida específicamente en un sitio dentro de un sustrato de ADN de plásmido. Importante, este enfoque evita el uso de materiales radiactivos y no es dependiente de la tecnología costosa o altamente especializado. En cambio, se basa en procedimientos estándar de ADN recombinante y la instrumentación (qPCR) la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real, cuantitativa ampliamente disponibles. Dada la flexibilidad inherente de la estrategia utilizada, el tamaño de la proteína del reticulado, así como la naturaleza de la vinculación química y el ADN preciso contexto de la secuencia del sitio de fijación puede ser variada para hacer frente a las contribuciones respectivas de estos parámetros para la eficacia total de la reparación de la DPC. Usando este método, plásmidos que contienen una DPC específica fueron transfected en las células y ADN de bajo peso molecular se recuperó en distintos tiempos después de la transfección. Recuperado DNA después es sometida a la extensión de la cartilla específica del filamento (SSPE) usando una cartilla complementaria a la hebra dañada del plásmido. Desde el DPC lesión bloques Taq ADN polimerasa, la proporción de ADN reparado a no reparada puede evaluarse cuantitativamente mediante qPCR. Valores del ciclo umbral (CT) se utilizan para calcular el porcentaje de reparación en varios puntos del tiempo en las líneas celulares respectivos. Este método de PES-qPCR puede utilizarse también para evaluar cuantitativamente la reparación cinética de cualquier ADN aducción que polimerasa de Taq de bloques.

Introduction

Descritos es un ensayo basado en PCR denominado panencefalitis esclerosante SUBAGUDA-qPCR. El propósito de este método es cuantificar la reparación DPC en plásmido que DNA transfected en las células mamíferas deficiente y competente servicio. Este análisis es extremadamente flexible, rápida y cuantitativa, y directamente medidas reparación actividad. Aunque este informe se centra en el uso de esta metodología para el estudio de reparación de DPC, resultados presentados a continuación ilustran que la reparación de cualquier lesión que bloquea Taq polimerasa puede estudiarse utilizando esta metodología.

El fundamento detrás del desarrollo de este método es profundizar en los mecanismos a través del cual las células mamíferas reparacion DPC. A diferencia de otros tipos de daños en el ADN, DPC es enormemente diversos1,2. Los estudios han demostrado que cientos de proteínas celulares pueden ser reticulado al ADN y que para cada proteína hay, en principio, numerosas cadenas laterales de aminoácidos que podrían apegarse covalentemente al DNA celular3. Además, hay numerosos puntos de fijación química de proteínas en la espina dorsal de la DNA, incluyendo varias posiciones en las bases de nucleótidos, así como en el de4,de azúcar ribosa5. Esta diversidad química plantea la posibilidad de que las vías bioquímicas distintas pueden depender para reparar diferentes tipos de DPC. Fue con esta preocupación en mente que se desarrolló el ensayo qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA.

Se han desarrollado varias técnicas para ganar la penetración en la biología molecular de la reparación celular de DPC. A continuación ofrece un resumen de los principales enfoques que se han desarrollado, con un resumen de las principales fortalezas y debilidades cada uno posea. Vale la pena destacar que aunque este resumen se centra en estudios de reparación DPC en sistemas de cultivo de células de mamífero, contribuciones significativas en el modelo actual de la reparación de la DPC se han efectuado utilizando sistemas microbianos y libres de células que no se discuten en este manuscrito.

Quizás la estrategia más fácil que se puede tomar para ganar la penetración en la genética de la reparación DPC es evaluar la sensibilidad correspondiente a la muerte celular en células de tipo salvaje y mutantes expuestas a agentes que inducen la DPC6,7. Esta estrategia es relativamente rápido, barato y no requiere conocimientos especializados más allá de la capacidad para realizar técnicas de cultivo de célula básica. Contrarrestar estas ventajas es numerosas limitaciones a este enfoque como la siguiente. En primer lugar, el ensayo no mide directamente la reparación del ADN. La hipótesis de trabajo que subyace a esta estrategia es hacer inactivo mutaciones en genes que codifican las proteínas de reparación de DNA resulta en una acumulación de ADN daños que desencadena la muerte programada de la célula. Sin embargo, mutaciones en genes que codifican proteínas de reparación del ADN no podrían, en principio, aumentar (o reducir) sensibilidad celular a la muerte celular inducida por xenobióticos. En segundo lugar, los agentes que crean DPCs invariablemente inducen otros tipos de daño de la DNA (una excepción es la 5-aza-2′-deoxycytadine, pero este agente también agota metiltransferasa celular niveles8). Por lo tanto, es concebible que la hipersensibilidad celular mayor al agente en cuestión puede reflejar defectos en la reparación de vínculos cruzados uniones u otras lesiones. En tercer lugar, como se mencionó anteriormente, DPC representa una clase muy heterogénea conformada por diferentes tipos de vínculos químicos cruzados, con socios diferentes de proteínas. Es posible que mientras que la reparación de uno o más subtipos de estas lesiones se puede alterar en un determinado fondo genético, esta diferencia puede no ser suficiente para alterar significativamente la hipersensibilidad celular a la muerte inducida por este agente. En Resumen, mientras que esta estrategia representa un atractivo punto de partida, las limitaciones señaladas destacan la importancia de buscar métodos más directos para estudiar la cinética de reparación DPC.

Ha desarrollado una serie de enfoques relacionados para lograr este objetivo. Por ejemplo, los investigadores han desarrollado métodos para distinguir entre el ADN de ‘libre’ y ‘protein-bound’ ADN9,10,11. Utilizando estos métodos, es posible comparar los niveles de estado estacionario de DPC o siguiente exposición a un agente de producción de DPC en diferentes fondos genéticos. Las dos estrategias que han sido más ampliamente utilizadas incluyen separar DPC-que contienen ADN de ADN gratis usando una estrategia de unión de membrana de nitrocelulosa o KCl/SDS precipitación12,13. En el enfoque anterior células son sometidas a lisis y pasa a través de un filtro de nitrocelulosa. Porque la nitrocelulosa une a la proteína, el filtro retiene el ADN ligado a proteínas, permitiendo ADN libre para pasar a través. En la estrategia de esta última unida a las proteínas de ADN se separa de ADN libre basado en el hecho de que se une a proteínas pero no de ADN y puede ser precipitado por la adición de KCl, SDS. En consecuencia, ADN ligado a proteínas se convierte en insoluble mientras que el ADN permanece en solución. DPC-que contienen ADN entonces puede ser cuantificado utilizando timidina radiactiva (si las células fueron etiquetadas inicialmente metabólicamente) o por un tinte fluorescente selectiva de DNA como Hoechst 33258. Estos métodos son reproducibles y requieren un número pequeño de pasos. Sin embargo, no proporcionan información sobre la naturaleza de la reticulación química a través del cual la proteína se une al ADN. Además, es importante tener en cuenta, estos ensayos pueden sobreestimar DPC reparación marcando falso reparación incompleta, es decir, proteolíticas procesamiento de vínculos cruzados ADN-péptido más pequeños que no pueden ser fácilmente atrapados o precipitado, como ADN de buena fe de la reparación.

Ensayos de la cometa pueden utilizarse para visualizar la formación de DPC en células14. En estos experimentos, la presencia de DPC disminuir migración de DNA que puede revertirse después de pretratamiento con proteinasa K. Por lo tanto, la longitud de la cola puede utilizarse para estimar la formación DPC. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, drogas formadoras de DPC crean otros tipos de daños en el ADN que podría alterar la longitud de la cola. Este protocolo también es altamente técnico y requiere conocimientos y capacitación en proyección de imagen confocal.

Espectrometría de masas puede utilizarse para estudiar la cinética de reparación DPC después del tratamiento con crosslinking agentes15,16,17. Estos experimentos tratan células con agentes formadores de DPC y aislar DPCs mediante extracción de biotina captura o fenol: cloroformo (1:1). Espectrometría de masas puede utilizarse entonces para identificar las proteínas reticuladas o cuantificar la cantidad de CPD formado con el tiempo. La gran ventaja de este enfoque es la naturaleza de los datos producidos. Es posible precisamente catálogo de los tipos de proteínas que se convierten en reticulado después de la exposición a xenobióticos, sin embargo, este protocolo es caro, consume tiempo y es limitado por el tipo de reticulación que puede ser detectada.

Maizels et al desarrollaron un sensible ‘RADAR’ (enfoque rápido de ADN aducción recuperación) ensayo para cuantificar la inmunodetección de proteínas ADN aductos así como un RADAR basado en ELISA ensayo18,19. Estos ensayos son especialmente útiles para atrapando productos intermedios de la DNA-proteína que transitoriamente forman en las células y generan muestras adecuadas para espectroscopía de masas identificar nuevas proteínas aductos. Este ensayo de inmunodetección se basa en la disponibilidad de anticuerpos específicos para capturar la reticulación de la DNA-proteína y, por lo tanto, puede no ser capaz de detectar ADN degradado-péptido aductos que se forman durante la reparación. Recientemente, una DPC específica reparación camino vinculado a la replicación del ADN y un pesar de ADN-dependiente Spartan fue descubierto en que DPC son proteolyzed a péptidos más pequeños durante la reparación de20,21. Mutaciones hereditarias en este gen están asociadas con síndrome Ruijs Aalfs en seres humanos, una enfermedad caracterizada por la inestabilidad genómica, envejecimiento prematuro y cáncer de hígado22. Ratones con defectos de gene Spartan genéticamente Mostrar fenotipos similares23.

Reactivación de la célula huésped de la actividad transcripcional se ha utilizado para estudiar la reparación de lesiones definidas en el DNA de plásmido transfected sustratos24,25. En estos experimentos, plásmido que contienen CPD (u otros tipos de lesiones del ADN) que bloquean la transcripción de un reportero, como luciferase, son transfected en las células. Medidas de luminiscencia tomado 24-72 h más tarde se correlacionan luego con DPC de la reparación. Sin embargo, estos ensayos de reparación indirecta son incapaces de detectar eventos de reparación antes que la transfección de 24 h y no pueden distinguir entre el bypass de la ARN polimerasa de sustratos parcialmente reparados y reparación completa.

Cada uno de los métodos descritos anteriormente tiene ventajas y ha contribuido al actual modelo de reparación DPC. Sin embargo, el ensayo qPCR PES sortea varias de las limitaciones asociadas con estos otros enfoques y por lo tanto puede proporcionar visión más específica de mecanismos de reparación DPC. Por ejemplo, el ensayo qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA puede medir directamente la reparación de DPC específica sobre el ADN en células de mamífero intactas. Este método es versátil y se ha utilizado para obtener resultados de reparación tras la transfección en hámster y líneas celulares humanas. Transfección del plásmido puede realizar lipofection o electroporación en líneas de células de mamífero cultivadas. También asegura que sólo reparación de DPCs definidos se mide, y no otros tipos de daños en el ADN inducido por la mayoría de agentes formadores de DPC. La panencefalitis esclerosante SUBAGUDA-qPCR es fácil de realizar, barata y rápida. Resultados obtenidos con este análisis han detectado eventos de reparación tan pronto como la transfección de 2 h. Usando este método, las variables que pueden influir en los resultados de reparación DPC pueden ser estudiadas de una manera sensible y eficiente. Por ejemplo, el papel de la transcripción en la reparación del DPC todavía debe evaluarse rigurosamente. Debido a la flexibilidad del ensayo qPCR de la SSPE, el sitio de entrecruzamiento de la DPC se puede manipular para abordar esta cuestión. Además, introducción de un origen de replicación en el plásmido de DPC-cojinete puede utilizarse para abordar la influencia de la replicación en reparación DPC. Asimismo, se pueden crear múltiples reticulaciones en el plásmido para examinar las diferencias en la reparación de un DPC solo versus múltiples reticulaciones. Estas son preguntas que serían difícil de responder usando la DNA cromosómica pero pueden fácilmente resolverse usando el análisis de qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA. General, el análisis de qPCR PES requiere purificada, DNA del plasmid en cantidades de microgramos que contiene una lesión de un lugar conocido. Aductos además de DPC puede ser utilizado en este ensayo, sin embargo, la lesión debe ser capaz de bloquear la extensión por la polimerasa de Taq.

Protocol

1. generación de plásmido que contiene el DPC 80 pmol de oligonucleótidos que contienen un residuo de 8-oxoguanine (20 μl) se combinan con 10 unidades de T4 kinase de Polinucleótido (1 μl) en solución tampón 10 x ligasa (5 μl). Añadir agua hasta alcanzar un volumen total de 50 μl e incubar a 37 ° C por 30 min en un baño de agua caliente. Combinar el oligonucleótido fosforilado (50 μL), 80 pmol de ADN (80 μL), 100 unidades Taq polimerasa (20 μl) en 10 x Taq buffer de reacción (25 μl), 100 mM ATP (20 μl), 10 mM dNTPs (20 μl), NEB buffer 2 (25 μl) y 8 μg BSA (20 μl) en total 260 μl. Incubar el muestra en un termociclador a 75 ° C durante 15 min, seguido de 37 ° C durante 5 minutos. A continuación añadir 60 U de T4 polimerasa (20 μl), 8.000 U T4 ligasa (20 μl), 100 mM ATP (20 μl), 10 mM dNTPs (20 μl), NEB buffer 2 (15 μl) y 8 μg BSA (20 μl) en total 375 μl incubar la reacción durante la noche a 37 ° C (figura 1A). Crear una mezcla de 50: 50 tampón saturada de fenol: cloroformo. Añadir volúmenes iguales de cada componente, mezcla y girar en una centrífuga de mesa a 21.130 x g por 5 min unidades de cloroformo agua tampón saturada de fenol para formar dos capas: una capa superior, acuosa y una parte inferior, la capa orgánica. Añadir 375 μl de la capa inferior, orgánica a la reacción de extensión de la cartilla, mezcla y girar en una centrífuga de mesa a 21.130 x g durante 5 minutos.PRECAUCIÓN: Fenol y cloroformo son sustancias peligrosas y deben tomarse precauciones para evitar el contacto con los ojos o la piel. Tras centrifugación, cuidadosamente extraer la capa superior y mezclar con acetato de amonio a una concentración final de 0,3 M, seguido de 2 volúmenes de etanol al 100%. Almacenar la solución a-20 ° C durante un mínimo de 30 minutos o durante la noche. Girar la muestra en una centrífuga de mesa a 15.000 rpm x a 4 ° C durante 10 minutos retirar el sobrenadante y lavar el precipitado en 1 mL de etanol al 70%. Hacer girar la muestra en una centrífuga de mesa a 15.000 rpm x a 4 ° C por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 μl de agua. Combinar 50 μl del ADN desde el paso anterior con 16 μl 6 x carga de gel colorante y 34 μl de agua y sometidos a electroforesis en una agarosa de la bajo-derretir de 0,8% del gel con bromuro de etidio 0.5 μg/mL. Correr el gel en 2 V/cm en un gel de 10 cm para 6 h en buffer de x TAE 1. Suprimir la banda superenrollada utilizando una hoja de afeitar y pesa el trozo de gel (figura 1A). Ejecutar un control positivo para servir como un marcador donde migra el ADN superenrollado, covalentemente cerrado.PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno y deben tomarse precauciones para evitar el contacto con la piel. También, es importante minimizar el tiempo que la muestra de plásmidos está expuesta a los rayos UV para reducir la formación de photoproducts de UV. Digerir el trozo de gel mediante la adición de tampón de reacción 10% agarase β para cada mg de gel de peso. Incubar a 65 ° C durante 10 minutos y enfriar a 42 ° C. Añadir 10 U de β-agarase e incubar a 42 ° C durante 1 hora. Siguiente incubación, medir el volumen y añadir acetato de amonio a una concentración final de 0.3 M y enfríe en hielo por 15 min la centrifugadora a 15.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente, recoger el sobrenadante y añadir 2 volúmenes de isopropanol. Enfriar a-20 ° C durante la noche. El ADN superenrollado, purificado por 10 min a 15.000 rpm x en una centrífuga de mesa a 4 ° C de centrifugar y resuspender el pellet en 40 μl de agua. Reticulación 12 pmol (15 μl) de la DNA a 36 pmol de oxoguanine glicosilasa (1 μl) en solución tampón que contiene 100 mM de NaCl (3 μL), 1 mM MgCl2 (3 μL), 20 mM Tris-HCl pH 7.0 (6 μl) y 10 mM cianoborohidruro de sodio (2 μL) para llegar a un volumen final de 30 μl a 37 ° C para 30 min26. Quitar 1 μl de la muestra de reticulado y diluir en 500 μl de agua para servir como un 0 h punto de datos y analizan en la PCR en el paso 3. 2. kCl/SDS precipitación Para visualizar la eficiencia de la reticulación, restricción digiere 1 μg de plásmido reticulado con 1 μL DI Bspen buffer de x 10 a 37 ° C durante 1 hora generar dos fragmentos de ADN de tamaño diferentes.Nota: Un fragmento será reticulado a proteína (4,4 kb) y el otro no (2,8 kB) (figura 1B). Dividir las muestras en la mitad, añadir SDS a ambos a una concentración final de 0,5% e incubar a 65 ° C durante 10 minutos. Añadir KCl (concentración final 100 m m) a una de las muestras e incubar en hielo durante 5 minutos. Centrifugar dos muestras a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C y correr los sobrenadantes en un gel de agarosa para estimar la conjugación por ciento de proteína a ADN12.Nota: Precipitación de KCl/SDS se utiliza para control de calidad, preparación del sustrato. 3. transfección en células de mamíferos 1 día antes de la transfección, placa de 0.5 x 106 células/pozo en una placa de 6 pozos. Al día siguiente, mezcle 1.5 μg (30 μL) del plásmido que contiene el DPC (de paso 1.6) con 300 μL de medio de cultivo libre de suero. En otro tubo, mezclar 12 μl de reactivo de transfección y 300 μL de medio de cultivo libre de suero. Combinar 300 μL del ADN diluido con 300 μL de reactivo de transfección diluido e incubar por 5 min a temperatura ambiente. Añadir 250 μl de los complejos a cada uno de dos pocillos e incúbelos durante un mínimo de 1 h a 37 ° C. Tras incubación, retirar los medios de comunicación, añadir 1 mL de EDTA de SDS/0,01 M de 0.6%, incubar a temperatura ambiente por 10-15 minutos raspar las células usando a un policía de goma y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 200 μL de invertir de (concentración final de 1 M), de 5 M de NaCl suavemente 5 veces e incubar a 4 ° C durante la noche27. Centrifugar las muestras a 21.130 x g en una centrífuga de mesa a 4 ° C durante 30 minutos, recoger el sobrenadante, precipitado etanol como se describe anteriormente y resuspender en 50 μl de agua. 4. pes-qPCR Mezclar 1 μl de ADN recuperado de cada punto del tiempo (incluyendo h 0), 2 x master mix de verde de SYBR PCR (30 μL), 27 μl de agua y 1 μl (100 pMol) de cartilla complementaria a la hebra de daño del plásmido (Primer R, figura 2). Realizar PCR utilizando las siguientes condiciones: inicial pre-derretimiento 10 min a 90 ° C, seguido de 8 ciclos de: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. En la terminación del ciclo 8 añadir 1 μl (100 pMol) de la segunda cartilla para total 60 μL (Primer L, figura 2)28 (véase Tabla de materiales de información de reactivo). Mezclar 1 μl de amplificados se recuperó ADN de cada punto del tiempo (incluyendo h 0), 2 x master mix (30 μL), 27 μl de agua y 1 μl de cada cebador (100 pMol) a total 60 μL. Carga una placa PCR de 96 pocillos con las muestras de los pasos 4.1 y 4.2 (20 μL/pocillo, por triplicado) y realizar la qPCR para 30 ciclos con las condiciones descritas anteriormente. Promedio de los valores de CT de cada conjunto de muestras por triplicado. Restar los valores de CT generados en el paso 4.1 de ésos en el paso 4.2 para obtener el valor de CT para cada muestra del delta. Reste el momento 0 h del valor delta CT para eliminar cualquier fondo (ver Resultados a representante de sección para una descripción detallada). Convertir el delta del valor de CT en reparación por ciento mediante la fórmula:

Representative Results

Para utilizar el ensayo qPCR de la SSPE para evaluar la reparación celular de la DPC, debe prepararse una cantidad suficiente (cantidades μg) de DPC reparación de sustrato de alta calidad. Para obtener este producto, un oligonucleótido que contiene un residuo de 8-oxoguanine fue recocido a complementarias ADN, primer extendido y gel purificado para garantizar que sólo covalentemente cerrado producto circular fue transfecciones (figura 1a). este informe se centra en sustratos que atrapan el hidruro de boro se utiliza para crear una reticulación covalente entre glicosilasa oxoguanine humana recombinante y una unidad de ribosa en una molécula de doble hebra circular plásmido, aunque análogo enfoques puede utilizarse para obtener sustratos químicamente diversos de DPC. La estrategia de captura glicosilasa/borohidruro oxoguanine es especialmente atractiva dada la eficacia extremadamente alta de la reacción de reticulación. Como se muestra en la figura 1B, precipitación de KCl/SDS realiza sobre un sustrato DPC que había sido digerido en dos fragmentos selectivamente y cuantitativamente casi agotan el fragmento de ADN que el DPC. Estos resultados apoyan la conclusión de que esencialmente el 100% de las moléculas de sustrato de plásmido contiene una proteína reticulación. El análisis de qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA que se describe en la sección de protocolo utiliza valores de CT generados por qPCR para calcular el porcentaje de reparación DPC tras la transfección en células de mamíferos. Como se ilustra en figura 2 , la reticulación de proteínas bloquea la Taq polimerasa de extender la cartilla ‘R’ recocida a la hebra que contiene el DPC. Una característica crítica, segunda de este ensayo es la incorporación de ocho rondas de reacciones de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA (utilizando la cartilla de R) antes de realizar el análisis de qPCR. Mientras que el ADN intacto (o reparado) se extenderá durante estas reacciones de la SSPE, creando un sitio obligatorio de la cartilla ‘L’ downstream, dañado DNA (o ADN reparado) no se ampliará. En consecuencia, la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA aumenta la abundancia de cada hebra intacta (o reparado) por eight-fold. Esto quiere decir que repare las muestras en las que el paso de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA se ha realizado antes de qPCR mostrará un valor de CT que es tres unidades menores que la obtenida para una muestra idéntica en que PES no se realizaron antes de qPCR (figura 2). La diferencia de tres unidades de CT valores observados para los dos tratamientos, contemplados como ΔCT, refleja el hecho de que 8 = 23. Este delta valor de CT se puede utilizar para calcular la actividad de reparación del ADN celular mediante la fórmula: reparación del ADN por ciento = (2ΔCT /23) x 100. Experimentos de control confirmó que un delta valor de CT de aproximadamente 3 se observó constantemente cuando plásmidos sustrato intacto fueron sometidos a la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA-qPCR (datos no mostrados). Tabla 1 muestra valores de ejemplo CT que se generaron a partir de sustratos de plásmido que contiene el DPC que fueron recuperados de fibroblastos de pulmón de hámster chino 3 h y transfección después de 8 h (tabla 1A), así como de tiempo cero muestras, es decir,, muestras que fueron preparadas como se describe en la sección de protocolo, pero no transfected en las células (tabla1B). La tabla también proporciona el ΔCT, y % reparación de valores (calculado utilizando la fórmula de 2ΔCT23 x 100) obtenidos de estas muestras. Como se ilustra en la tabla 1A, la reparación por ciento calculada a partir de las muestras cosechadas 3 h y transfección después de 8 h fue 66% y 93%, respectivamente. Estos valores se restan luego de eso obtenidos del análisis de la muestra h 0 para determinar el porcentaje de reparación. Tabla 1B muestra valores de CT de dos muestras diferentes de 0 h entrecruzamiento eficiente fue o no fue alcanzada antes de transfección. Eficientemente reticulado muestra dio lugar a un delta valor de CT de 0,8 mientras que una muestra mal reticulado dio lugar a un delta valor de CT de 2.5. Hasta la fecha, no ha sido posible determinar exactamente la fuente de la señal de fondo 0,8 en el eficiente reticulado muestra de 0 h. Es poco probable que este fondo refleja un bajo nivel de o eliminación espontánea de DPC, o es debido a un bajo nivel de Taq polimerasa ‘bypass’ síntesis a través de la lesión DPC: extensa experimentación realizada en altamente purificada sola M13 sustrato siempre rindió un delta valor de CT de aproximadamente 0,8, es decir, esencialmente idéntico a este ‘fondo’ extensión en sustratos que contengan DPC. En consecuencia, es probable que exista un pequeño grado de mal cebado de la cartilla ‘R’ en SSPE resultados en la generación de una pequeña cantidad de producto que posteriormente se amplifica cuando se agrega la cartilla ‘L’ y qPCR. A la fecha, los esfuerzos para eliminar este fondo mediante la manipulación de las condiciones PCR han podido remediar este defecto. Sin embargo, la estrategia de resta descrita permite una estimación precisa de la actividad de reparación DPC. Vale la pena observando ese entrecruzamiento ineficiente de la proteína en el plásmido resultará en un valor de base elevado. Esto se muestra en los datos de muestra proporcionados en la Tabla 1B donde ineficiente ADN proteína reticulación dio lugar a un delta de mayor valor de CT para el tiempo 0. Por lo tanto, experimentos de control siempre se realizan antes de iniciar transfecciones y sustratos con valores de CT de delta elevados por encima de 0.8 nivel de umbral se descartan. Como se menciona en el protocolo de qPCR, cada muestra se divide en 3 pozos para asegurar la consistencia de pipeteo. Estas repeticiones entonces se calcula el promedio para obtener el valor de CT para esa muestra. Replica que se desvían más de ± 0.1 se eliminan del conjunto de datos. Si todos tres repeticiones se desvían más de ± 0.1 unos de otros, se rehace el ensayo qPCR de PES hasta que se obtienen valores coherentes. La experiencia demuestra que por lo menos 3 transfecciones independiente deben realizarse para obtener los valores promedio confiables que luego pueden ser sometidos a análisis estadísticos para determinar la influencia de diversos parámetros sobre la eficiencia de reparación DPC. Figura 1. Generación de un plásmido que contiene el DPC. (A) un oligonucleótido que contiene un residuo de 8-oxo-guanina (rojo) es recocido para ADN (círculo negro bold) y extendido para crear doble cadena plásmido (cartilla extensión de productos indicada por línea discontinua). Tras la electroforesis en bromuro de etidio, la banda correspondiente a ADN superenrollado (caja roja) es suprimida de un gel de agarosa de la bajo-derretir y digerida con β-agarase. Rutas: (1) Peso Molecular marcador, (2) ADN, (3) doble ADN, muestra extendido (4) primer. (B) Oxoguanine glicosilasa (hOGG1 abreviado, representado como un círculo naranja) es reticulado para el residuo de la 8-oxo-guanina vía cianoborohidruro de sodio y el consiguiente DPC sustrato digerido para generar un par de base de 2.800, fragmento de ADN libre y un 4.400 fragmento unido a la proteína. SDS se agrega a la muestra que luego se divide en dos tramos, uno de los cuales es tratado con KCl y se centrifugó al sedimento del ADN que contiene el DPC (representado como una pelotilla naranja). El sobrenadante de esta última muestra (representado como azul líquido en tubo de centrífuga) y la muestra no expuesto a KCl se someten a electroforesis en gel. Rutas: (1) de peso Molecular marcador, (2) -KCl, (3) + KCl. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: cuantificación de plásmido dañado mediante qPCR PES. Plásmido de ADN está desnaturalizado y una cartilla complementaria a la hebra dañada (R) es recocida y extendida. Este proceso se repite para un total de 8 ciclos. Con un sustrato dañado (arriba), Taq polimerasa es bloqueado por la lesión DPC y no producen filamentos de producto completas. En cambio, con un sustrato reparado (parte inferior), Taq polimerasa producirá productos largos filamentos que contiene el sitio de Unión para el primer L. Después de 8 ciclos, primer L se agrega, y valores de umbral de ciclo se determinan usando qPCR. Resultados de amplificación ejemplo para sustratos dañados y en buenas condiciones se ilustran a la derecha con la línea roja que representa el ADN que experimentó la extensión de la cartilla antes de qPCR y azul que representa el ADN que no era primer extendida antes de qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1A Tiempo -Extensión cartilla + Extensión cartilla Δ CT Reparación por ciento (2ΔCT23x 100) 3 h 23.5 21.1 2.4 66 8 h 29.4 26.5 2.9 93 Tabla 1B Tiempo -Extensión cartilla + Extensión cartilla Δ CT Fondo por ciento (2ΔCT23x 100) 0 h 15.4 14.6 0,8 22 0 h 15.4 12.9 2.5 71 Tabla 1: cálculo de por ciento de reparación utilizando los valores de CT generados a partir de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA-qPCR. (A) reparación de un substrato que contiene la DPC transfected en fibroblastos de pulmón de hámster chino V79 3 h y transfección después de 8 h. (B) panencefalitis esclerosante SUBAGUDA-qPCR de muestras 0 h no transfectadas en las células. En una muestra de la eficiencia de la reacción de reticulación entre el ADN y oxoguanine glicosilasa fue alta (esta muestra rindió un valor bajo delta CT) mientras que en la otra muestra la eficacia de la reticulación de proteínas fue baja (esta muestra rindió un relativamente alto delta Valor de CT). Véase el texto de Resultados de representante para obtener más información.

Discussion

El método PES-qPCR ofrece numerosas ventajas sobre otros enfoques mediante el examen de la reparación de una población homogénea que contiene una lesión única y definida del DPC. Cabe destacar que además de controlar la identidad de la proteína y el tipo de reticulación química utilizado para conectar la proteína al ADN, es posible manipular fácilmente el contexto de la secuencia en que se presenta la lesión DPC. Hemos explorado la influencia en la reparación de la DPC de introducción la lesión ya sea la plantilla o hebra de un plasmidio aguas abajo de un sitio promotor activo de codificación. Del mismo modo, estamos en el proceso de investigar la influencia en la reparación de la DPC de replicación con un plásmido de M13, que contiene un origen de replicación transfectada en las células HEK293T de SV40. El análisis aquí descritos directamente reparación DPC de medidas, a diferencia de otras estrategias como la reactivación de la célula anfitrión que indirectamente estimaciones reparación actividad24,25. Además, el sistema es sólido, sensible y cuantitativo. A diferencia de otros sistemas, que medir la eliminación de la DPC, este ensayo sólo detecta la reparación completa de eventos, es decir, se requiere no sólo quitar la lesión DPC sino que la integridad del ADN duplex totalmente restaurado17. Esto es porque un sitios y mellas o roturas en el esqueleto fosfodiéster bloquean el ensayo tan eficazmente como el CPD original lesión29.

Aunque este informe se centra en un tipo particular de DPC, que fue creada por captura de borohidruro de una reacción enzimática intermedia, actualmente estamos desarrollando enfoques para estudiar reparacion de DPC con otras proteínas y lesiones en las que el acoplamiento de la proteína a el ADN se produce a través de la base de nucleósidos, en lugar de la posición de la ribosa. Mediante aminación reductora, hemos creado vínculos cruzados de proteínas y péptidos a la guanina o citosina base de DNA cartilla30. Estos oligonucleótidos se purificada a homogeneidad y solía generar superenrollados plásmidos que contienen ADN y proteínas y el ADN-péptido reticulaciones. Mientras que la eficacia de estas reacciones es algo reducida en relación a la del enfoque oxoguanine glicosilasa reticulación que se describe en detalle más arriba, sin embargo tuvieron éxito y permitir el examen de la reparación de estos substratos en el tipo salvaje y nucleótido supresión deficiente reparación de células de mamífero. También hemos utilizado el ensayo qPCR de la SSPE para el estudio de la reparación de las lesiones oxoguanine y un conjugado sintético ribosa-colesterol, que previamente fue demostrado para ser reparado por el nucleótido celular supresión reparación maquinaria31. Como la figura 2 muestra gráficamente, reparación de cualquier lesión que extensión de la cartilla de bloques por la polimerasa de Taq, en principio, se pueda medir usando el análisis de qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA.

Modelos actuales de la reparación DPC que sugieren grandes CPDS (> 10 kDa) son sometidos a procesamiento proteolítico para lesión más pequeña del péptido antes de eliminación32,33,34. Candidatos más probables responsables de esta proteólisis son el proteasoma o una proteasa específica en células humanas llamado Spartan20,21,35,36,37, 38. otras investigaciones sobre las funciones de estas proteasas pueden llevarse a cabo utilizando el ensayo qPCR de la panencefalitis esclerosante SUBAGUDA. Inhibidores de la proteasoma podrían utilizarse para pretratar las células antes de transfección con sustratos que contienen el DPC. Alternativamente, líneas celulares precipitación Spartan podrían ser transfected con plásmidos dañados para dilucidar su papel en la proteólisis de DPCs más grandes.

Independientemente del método utilizado para crear la reticulación o de la naturaleza de la lesión del DNA, es vale la pena destacar que la metodología PES-qPCR es críticamente dependiente de la capacidad para generar grandes cantidades de sustrato homogéneo de DPC-plásmido. Pasos esenciales para este análisis incluyen la purificación del covalente, plásmido circular cerrado tras la extensión de la cartilla para eliminar cualquier mellado o moléculas de plásmido lineal. Estos contaminantes deben eliminarse para asegurar que cualquier reparación DPC posterior observada no es debido a procesos de reparación de rotura dirigido dirigido por nick o doble cadena. No obtener cantidades suficientes de ADN superenrollado tras reacciones de extensión de la cartilla puede ser superado mediante la variación de la proporción de oligonucleótidos de ADN. Otro paso importante para el método PES-qPCR, es la eficiencia de la reticulación de la proteína para el plásmido. En este estudio, se utilizó una eficiente reacción enzimática de la proteína glicosilasa oxoguanine una lesión 8-oxo-guanina de la reticulación. El óptimo entrecruzamiento puede mejorarse mediante la variación de la cantidad de proteína añadida a la reacción.

Mientras que los resultados descritos en este informe dependían lipofection para introducir sustratos reparación DPC en células receptores, no es necesario, a priori, no podrían emplearse otros métodos de transfecciones. Hemos realizado estudios preliminares y observó que la electroporación39 también se puede utilizar. Sin embargo, cabe señalar en nuestra experiencia, eficacia de transfección de electroporación es reducido en comparación con lipofection y encontramos necesario utilizar ADN portador (hasta 5 μg) además de las 1,5 μg de DPC sustrato para obtener datos de reparación. En general, el método PES-qPCR descrito proporciona una manera innovadora exclusivamente examinar reparación DPC en plásmido ADN y generar nuevas perspectivas en la respuesta del daño de ADN.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (ES023350). Lisa Chesner es apoyado por la beca de formación 5T32HL007741. Agradecemos a Natalia Tretyakova (Universidad de Minnesota) y Ashis Basu (Universidad de Connecticut) y sus miembros de laboratorio de apoyo y asesoramiento técnico durante el temprano y las etapas intermedias de este trabajo.

Materials

8-oxoguanine modified oligo Midland Certified Reagent Company NA Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’
T4 PNK NEB M0201S
Single-stranded M13 NEB N4040S
Taq polymerase NEB M0267L
ATP, 100mM Thermo Scientific R0441
dNTP Mix, 10mM each Thermo Scientific R0192
BSA NEB B9001S
T4 polymerase NEB M0203L
T4 ligase NEB M0202L
β-agarase NEB M0392S
Oxoguanine glycosylase 1 NEB M0241S
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4309155 green PCR master mix
Primer R UMN Genomic Center NA 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’
Primer L UMN Genomic Center NA 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-012 transfection reagent 
BspD1 NEB R0557S
NEB buffer 2 NEB B7002S
StepOnePlus Real Time PCR System Applied Biosystems 4376600
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
Chloroform, reagent ACS, spectro grade ACROS 40463-5000
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DNA-protein CrosslinksPlasmid DNAMammalian CellsDNA RepairTrans-Pacific Primer Extension QPCR AssayAdductsPolymerase BlockingHouse Cell Reactivation8-oxoguanineT4 Polynucleotide KinasePrimer ExtensionPhenol-chloroform Extraction

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Chesner, L. N., Campbell, C. A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (133), e57413, doi:10.3791/57413 (2018).
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