シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

記載は PCR アッセイの呼ぶ SSPE qPCR。このメソッドの目的は、プラスミド DNA 修復欠損、熟練した哺乳類細胞にトランスフェクションの DPC 修理を定量化することです。この試金は急速な量的な非常に柔軟な直接対策修復活動。このレポートは、Dpc の修復を研究するこの方法の使用に焦点を当てて、次に示す結果は Taq のポリメラーゼは、この手法を使用して学ぶことができますをブロックする任意の病変の修復を示しています。

このメソッドの開発の後ろの理論的根拠は、哺乳類細胞修復 Dpc メカニズムに洞察力を得ることです。DNA 損傷の他の種類とは異なり Dpc は、大規模な多様な^1,2です。細胞蛋白質の数百が細胞の DNA³共有添付になることができる多数のアミノ酸側鎖が、原則として、各蛋白質の DNA に架橋をなることを調査は示した。さらに、ヌクレオチド塩基やリボース砂糖^4,5いくつかポジションを含む DNA のバックボーンに蛋白質の多数の化学装着ポイントがあります。この化学的多様性は、異なる生化学的経路は、Dpc の種類を修復するために依存可能性があります見通しを発生させます。心 SSPE qPCR 測定法が開発されたことでこの懸念だった。

いくつかの技術は、細胞の DPC 修復の分子生物学への洞察力を得るために開発されています。以下それぞれの所有に開発されている、主要な概要と強みと弱みの主要なアプローチの概要を説明します。この概要は、哺乳類の細胞培養系で DPC 修復の研究に焦点を当てて、DPC 修復の現在のモデルに大きく貢献されていないことこれで議論されていない微生物および細胞無料のシステムを使って強調し価値があります。原稿。

おそらく DPC 修理の遺伝学への洞察力を得るために取ることができる最も簡単な方法は、Dpc^6,7を誘導剤にさらされている野生タイプおよび突然変異体の細胞にみられる細胞死にそれぞれの感度を調べることです。この戦略は、比較的高速な安価なと基本的な細胞培養の技術を実行する能力を超えて専門知識を必要としません。以下を含む数多くの制限は、これらの利点をとるします。まず、アッセイは DNA 修復を直接測定していません。この戦略の基礎となる作業仮定は、関連 DNA 修復タンパク質をコードする遺伝子の突然変異を不活化こと、トリガー プログラム細胞死に損傷 DNA の蓄積の結果です。ただし、非 DNA 修復タンパク質をコードする遺伝子の変異が、プリンシパル、強化 (または削減) 異物による細胞死を細胞の感度。第二に、Dpc を必ず作成エージェント誘発 DNA 損傷の他の種類 (1 つの例外は 5-字-2′-deoxycytadine、しかしこのエージェントはまた細胞メチル基転移酵素のレベル⁸を激減させます)。したがって、考えられる問題のエージェントに強化された細胞過敏が鎖間の架橋やその他の病変の修復の欠陥を反映可能性がありますです。第三に、前述したように、Dpc クラスを表す非常に異種化学架橋の種類から成る異なる蛋白質パートナーを含みます。これらの病変の 1 つまたは複数のサブ型の修復は、特定の遺伝的背景の変更可能性があります、この相違ないことこのエージェントによる死細胞過敏症を大幅に改変するのに十分なことが可能です。要約すると、この戦略が魅力的な出発点を表します、上記制限は追求する DPC 修理の動力学を調査する他より直接的方法の重要性を強調します。

関連するアプローチの数は、この目的を達成するために開発されています。例えば、捜査官は、’自由’ DNA ‘蛋白結合’ DNA^9,10,11とを区別する方法を開発しました。これらのアプローチを使用して、Dpc や異なる遺伝的背景で DPC 生産エージェントへの暴露後の定常状態レベルを比較することが可能です。最も広く使用されている 2 つの戦略は、ニトロセルロース膜結合戦略または KCl/SDS 析出^12,13を使用して無料の DNA から DPC を含む DNA を分離することを含みます。前者の方法でセルを分離して硝酸セルロース フィルターを通過しました。硝酸セルロース結合するタンパク質と、ので、フィルターには許可を通過する自由な DNA 蛋白質リンクの DNA が引き継がれます。後者の戦略で蛋白結合 DNA は、事実に基づく SDS 蛋白質がない DNA に結合し、KCl の付加によって沈殿することができます無料 DNA から分離されます。その結果、ソリューションの中の非連結の DNA、蛋白質リンク DNA は不溶性になり。標識チミジンを使用して (細胞代謝最初ラベル付けされた) 場合は、DPC の DNA を測定し、ヘキスト 33258 のような DNA 選択的蛍光色素。これらのメソッドは再現可能な手順の数が少ないを必要とされます。ただし、彼らは蛋白質と DNA の関連付けに使用される化学架橋結合の性質に関する情報を提供しません。さらに、注意してください、これらのアッセイが DPC を偽って不完全な修理、すなわち、蛋白質分解処理を簡単にトラップまたは沈殿、善意の DNA としてことができない小さい DNA ペプチド クロスリンクの得点で修復を過大に評価することが重要です。修復します。

彗星の試金を使用して、DPC におけるセル¹⁴を視覚化できます。これらの実験で Dpc のプレゼンス低下, プロテイナーゼ K と前処理による元に戻すことができる DNA の移行したがって、尾の長さは、DPC 形成を推定する使用ことができます。ただし、前述のように、DPC 形成薬は尾の長さを変えることができる DNA の損傷の他の種類を作成します。このプロトコルは、高度な技術も、専門知識と共焦点レーザー顕微鏡の訓練が必要です。

質量分析法を使用して、架橋剤^15,16,17による DPC 修復動態を勉強できます。これらの実験は DPC 形成剤と細胞を扱う、ビオチン キャプチャまたはフェノール: クロロホルム (1:1) 抽出 Dpc を隔離します。質量分析法は、架橋タンパク質を特定したり、時間をかけて形成された Dpc の量を量的に使用できます。このアプローチの主な利点は、生成されるデータの性質です。正確にカタログ異物、ただし、このプロトコルへの暴露を次架橋になるタンパク質の種類は高価、時間のかかると検出できる架橋型によって制限することが可能です。

Maizelsら開発機密 ‘レーダー’ (DNA の急速なアプローチは、回復を付加体) レーダーの elisa 法を用いたアッセイ^18,19付加体の DNA 蛋白質のバイオアセッテイを量的に分析。これらのアッセイは、付加体の一過性細胞を形成し、新しい蛋白質を識別するために質量分析に適したサンプルを生成する中間物を DNA 蛋白質のトラップのために特に便利です。このバイオアセッテイ アッセイ dna-タンパク質クロスリンクをキャプチャする抗体の可用性に依存しているならず、したがって、劣化 DNA ペプチドは、修復中にそのフォームを付加体の検出が可能。最近、特定の DPC は DNA 複製や DNA 依存性メタロプロテアーゼ スパルタが発見された Dpc が、小さいペプチドに限定修理^20,21中にリンク経路を修復します。この遺伝子の受継がれた突然変異はヒトでは、Ruijs Aalfs 症候群、ゲノム不安定性、早期老化、肝臓がん²²疾患に関連付けられます。遺伝子組み換えの質素な遺伝子異常を持つマウスは、類似した表現型²³を表示します。

転写活性の宿主細胞を再活性化は、transfected プラスミッド DNA 基板^24,25の現在定義されている病変の修復を研究に使用されています。これらの実験は、Dpc (または他の種類の DNA 病変) を含んでいるプラスミッドの記者が、ルシフェラーゼなどの転写をブロック、細胞にトランスフェクションします。ルミネッ センス測定撮影 24-72 時間後、DPC と相関を修復します。しかし、これら間接修復アッセイが 24 h 後トランスフェクションより早く修復イベントを検出できる、部分的に修復された基板のバイパスによって RNA ポリメラーゼと完全な修復を区別できません。

上記の方法の利点は、DPC 修復の現在のモデルに貢献しています。しかし、SSPE qPCR 法はいくつかのこれらの他のアプローチに関連付けられている制限を回避、その結果 DPC 修復メカニズムにより特定の洞察力を提供することができます。たとえば、SSPE qPCR アッセイは、そのまま哺乳類細胞における DNA のサイト固有の Dpc の修理を直接測定できます。このメソッドは、汎用性、次のハムスターとひと細胞でのトランスフェクション修理結果を得るに使用されています。プラスミッドのトランスフェクションは、培養された哺乳類細胞のリポフェクション エレクトロポレーションを使用して実行できます。また、定義された Dpc の唯一の修理を測定すると、そのほとんどの DPC 形成エージェントによる DNA 損傷の他の種類を保証します。SSPE qPCR です実行する簡単・安価・迅速です。この試金を使用して得られた結果は、早ければ 2 h 後トランスフェクション修復イベントを検出しました。このメソッドを使用して、DPC の修理結果に影響を与える変数は敏感かつ効率的な方法で学ぶことができます。たとえば、DPC 修復における転写の役割はまだ厳しく評価します。SSPE qPCR アッセイの柔軟性のため、この問題に対処する DPC の架橋サイトを操作できます。さらに、DPC 軸受プラスミドにレプリケーション元の導入は DPC 修理上のレプリケーションの影響に対処するため使用できます。さらに、複数個のクロスリンク対単一の DPC の修理の違いを検討するプラスミッドの複数個のクロスリンクを作成できます。これらは、染色体 DNA を用いて回答するは難しいだろうが、SSPE qPCR の試金を使用して簡単に解決することができます質問。全体的に、SSPE qPCR アッセイ マイクログラム量既知の場所の病変を含むプラスミド DNA を精製が必要です。付加体のほかに DPC は、この試金で使用できます、ただし、病変は Taq のポリメラーゼによって拡張子をブロックすることにする必要があります。