JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Простой, быстрый и количественные Assay мера ремонт ДНК белковых сшивки на плазмид Transfected в клетки млекопитающих

Published: March 05, 2018
doi:
10.3791/57413
,
1Department of Pharmacology,University of Minnesota

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в количественном определении ремонт определенных ДНК белковых сшивки на плазмидной ДНК. Пораженного плазмид transfected в получателей mammalian клетки линии и низкомолекулярных вес, собирают в несколько раз очков после transfection. Кинетика ремонта ДНК количественно с помощью расширения ленты специфического праймера, следуют ПЦР.

Abstract

Этот метод призван служить гибким, быстрое и количественные техники для изучения кинетики ДНК белковых crosslink (DPC) ремонт в mammalian клетки линии. Вместо того чтобы глобально опробование удаления ксенобиотик индуцированной или спонтанное хромосомных DPC удаления, этот assay исследует ремонт однородной, химически определенных поражения, специально введена в одном месте в субстрат ДНК плазмиды. Важно отметить, что этот подход позволяет избежать использования радиоактивных материалов и не зависит от дорогих или высоко специализированной технологии. Вместо этого он полагается на стандартных рекомбинантной ДНК процедур и широко доступны в реальном времени, количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) инструментария. Учитывая гибкость стратегии использованы, размер высокоструктурированные белка, а также природу химической связи и точные ДНК последовательность контексте вложение сайта может быть изменено по решению соответствующего вклада этих параметры общей эффективности DPC ремонта. С помощью этого метода, плазмиды, содержащие участкам DPC были transfected в клетки и ДНК низкой молекулярной массой оправился в разное время после transfection. Восстановленные ДНК затем подвергается нити специфического праймера расширение (ПСПЭ) используя праймер дополняет стренги поврежденных плазмида. После поражения DPC блоков полимеразы дна Taq можно количественно оценить соотношение отремонтированы в ООН отремонтированы ДНК с помощью ПЦР. Цикла порог (CT) значения используются для расчета процента ремонта в различные моменты времени в соответствующих клеточных линий. Этот метод ГНПП ПЦР может также использоваться для количественной оценки ремонта кинетика любой ДНК аддукт что блоков Taq-полимеразы.

Introduction

Описанные здесь называется на основе ПЦР анализа ГНПП ПЦР. Цель этого метода заключается в количественном определении DPC ремонт на что transfected в ремонт несовершенным и опытным mammalian клеток ДНК плазмиды. Этот assay быстрое, количественных, чрезвычайно гибкой, и непосредственно мер восстановления деятельности. Хотя настоящий доклад сосредоточен на использование этой методологии для изучения ремонт DPC, представленные ниже результаты показывают, что ремонт любой поражения что блоков Taq-полимеразы могут быть изучены с использованием этой методологии.

В развитие этого метода лежит лучше понять механизмы, через которые mammalian клеток ремонт DPC. В отличие от других типов повреждения ДНК DPC, массово разнообразных1,2. Исследования показали, что сотни клеточных белков может стать высокоструктурированные ДНК, и что для каждого белка, в принципе, есть многочисленные боковые цепи аминокислоты, которые могли бы стать ковалентно присоединены к клеточной ДНК3. Кроме того существуют многочисленные химические крепления для белков на ДНК позвоночника, включая несколько позиций на нуклеотидных баз, а также на4,сахара рибозы5. Это химические разнообразие вызывает перспектива того, что различные биохимические пути может полагаться на ремонт различных видов DPC. Именно с этой озабоченностью в виду, что ГНПП ПЦР анализа была разработана.

Чтобы разобраться в молекулярной биологии сотовых Ремонт DPC были разработаны несколько методик. Ниже приводится обзор основных подходов, которые были разработаны, с кратким изложением основных сильных и слабых сторон каждого владеть. Следует подчеркнуть, что хотя это резюме фокусируется на исследования DPC ремонта в системах культуры mammalian клетки, значительный вклад в текущей модели DPC ремонта были предприняты с использованием микроорганизмов и клеток свободных систем, которые не рассматриваются в этом рукопись.

Может быть простой стратегии, которые могут быть приняты, чтобы разобраться в генетике DPC ремонта заключается в оценке соответствующих чувствительность к смерти клетки, наблюдается в клетках одичал типа и мутантов подвергается агентов, которые индуцируют DPC6,7. Эта стратегия является сравнительно быстрый, недорогой и не требует специальных знаний за пределами способность выполнять основные клеточные культуры технологии. Противовеса эти преимущества являются многочисленные ограничения такого подхода, включая следующие. Во-первых проба не непосредственно измерить репарации ДНК. Рабочая предпосылка, лежащая в основе этой стратегии является, что инактивации мутации генов, кодирующих соответствующих протеинов ремонта ДНК приводит к накоплению ДНК повреждения что триггеры запрограммированная смерть клетки. Однако мутации генов, кодирующих белки не ДНК ремонт может в принципе, повышение (или уменьшить) сотовых чувствительность к ксенобиотик индуцированной клеточной смерти. Во-вторых, агенты, которые создают DPC неизменно вызывают другие виды повреждений ДНК (единственным исключением является 5-Аза-2′-deoxycytadine, но этот агент также истощает сотовой метилтрансфераза уровни8). Следовательно это мыслимо, что расширение сотовой Гиперчувствительность к агенту в вопросе может отражать дефекты ремонта interstrand сшивки или других повреждений. В-третьих как было сказано выше, DPC представляют собой значительно гетерогенных класс состоит из различных видов химической сшивки, с участием партнеров различных белков. Вполне возможно, что хотя ремонт один или более вложенных типов этих поражений могут быть изменены в частности генетический фон, эта разница не может быть достаточно, чтобы значительно изменить сотовой Гиперчувствительность к смерти, вызванных этим агентом. В резюме в то время как эта стратегия представляет собой привлекательным отправную точку, ограничения, изложенные выше подчеркнуть важное значение осуществления других, более прямых методов для изучения кинетики DPC ремонта.

Для достижения этой цели был разработан ряд соответствующих подходов. Например следователи разработали методы, чтобы различать ДНК «свободный» и «protein-bound» ДНК9,10,11. С помощью этих подходов, можно сравнить стационарном уровнях DPC или следующие воздействия DPC-производство агента в различных генетических стола. Эти две стратегии, наиболее широко используемых связаны, отделяя DPC-содержащих ДНК от свободной ДНК с помощью стратегии привязки мембраны нитроцеллюлозы или KCl/SDS осадков12,13. В бывшем подход клетки лизированы и прошло через фильтр нитроцеллюлозы. Потому что нитроцеллюлоза связывает белок, фильтр сохраняет связанные белком ДНК, позволяя бесплатные ДНК, чтобы пройти через. В последнем стратегии белка прыгните ДНК отделена от свободной ДНК основывается на факте, что SDS связывает белок, но не ДНК и может быть спровоцирован добавлением хлористого калия. Следовательно белка связаны ДНК становится неразрешимой несвязанных ДНК остается в растворе. DPC-содержащих ДНК затем быть предел, с использованием radiolabeled тимидина (если клетки были первоначально метаболически обозначено) или путем селективного ДНК Люминесцентную краску как Hoechst 33258. Эти методы являются воспроизводимость и требуется небольшое количество шагов. Однако они не предоставляют информацию, касающуюся характера химических crosslink, через который белок прилагается к ДНК. Кроме того важно отметить, что эти анализы могут переоценивать DPC ремонт ложно скоринга неполного ремонта, то есть, протеолитических обработки небольших сшивки ДНК пептид, который не может быть как легко ловушку или осажденная, как bona fide ДНК ремонт.

Комета анализов может использоваться для визуализации DPC формирования в клетки14. В этих экспериментах присутствие DPC уменьшение миграции ДНК, которая затем может быть устранена путем предварительной обработки с K. протеиназы Таким образом длина хвоста может использоваться для оценки формирования DPC. Однако как упоминалось выше, DPC-формирование наркотиков создавать другие типы повреждения ДНК, которая может изменить длину хвоста. Этот протокол также является сугубо технический и требует опыта и профессиональной подготовки в конфокальная томография.

Масс-спектрометрия может использоваться для изучения кинетики ремонт DPC, после лечения с сшивки агентов15,16,17. Эти эксперименты лечить клетки с DPC-формируя агентам и изолировать DPC через биотина захвата или фенолом: хлороформ добычи (1:1). Масс-спектрометрия может затем использоваться для идентификации белков из сшитого или quantitate количество DPC, формировались в течение времени. Основным преимуществом такого подхода является характер получаемых данных. Это позволяет точно каталог видов белков, которые стали высокоструктурированные после воздействия ксенобиотик, однако, этот протокол дорого, много времени и ограничивается тип crosslink, которые могут быть обнаружены.

Мейзелс et al. разработали чувствительных «радар» (быстрый подход к ДНК аддукт восстановления) пробирного чтобы quantitate immunodetection ДНК белковых аддукты а также на основе ELISA радар пробирного18,19. Эти анализы являются особенно полезными для захвата ДНК белковых полуфабрикатов, которые временно формируют в клетках и создания образцов для масс-спектроскопии для выявления новых белков аддукты. Этот immunodetection assay полагается на наличие антител для захвата crosslink дна протеина и, таким образом, не могут быть способны обнаруживать деградации ДНК пептид аддукты формы во время ремонта. Недавно конкретные DPC ремонт пути, связанные с репликации ДНК и ДНК зависимая metalloprotease, спартанец был обнаружен в котором DPC являются proteolyzed для мелких пептидов во время ремонта20,21. Унаследованные мутации в этом гене связаны с Ruijs-Aalfs синдрома в организме человека, заболевание, характеризующееся геномной нестабильности, преждевременное старение и рак печени22. Мышей с генетически спартанских гена дефекты отображения аналогичные фенотипов23.

Хоста элементный возобновление транскрипционный анализ деятельности был использован для изучения ремонт определенных поражений на transfected плазмида ДНК субстратов24,25. В этих экспериментах, плазмиды, содержащий DPC (или другие виды повреждений ДНК), блокировать транскрипции репортер, например Люцифераза, являются transfected в клетки. Измерения люминесценции, принятых 24-72 ч позже затем коррелирует с DPC ремонт. Однако эти анализы косвенных ремонт способны обнаруживать события ремонт ранее чем через 24 ч после transfection и не могут различать между объездной РНК-полимеразы частично отремонтированы субстратов и капитальный ремонт.

Каждый из описанных выше методов имеет свои преимущества и способствовала текущей модели DPC ремонта. Однако ГНПП ПЦР позволяет обойти некоторые ограничения, связанные с этими подходами и следовательно может предоставить более конкретные проницательность в DPC ремонт механизмов. Например ГНПП ПЦР assay может непосредственно измерить ремонт участкам DPC на ДНК нетронутым клеток млекопитающих. Этот метод является универсальным и был использован для получения результатов ремонта после трансфекции хомяк и линий клеток человека. Трансфекция плазмида может производиться с использованием липофекция или электропорации в культивируемых клеток млекопитающих линий. Она также гарантирует, что только ремонт определенных DPC измеряется, а не другие типы повреждения ДНК, вызванные большинство DPC-формируя агентам. ГНПП ПЦР легко выполнять, недорогой и быстрый. Результаты, полученные с помощью этого анализа выявлено ремонт события 2 ч после трансфекции в кратчайшие сроки. С помощью этого метода, переменные, которые могут повлиять на результаты DPC ремонт могут быть изучены в манере, которая является чувствительным и эффективным. Например роль транскрипции в DPC ремонт еще предстоит тщательно оцениваться. Благодаря гибкости ГНПП ПЦР-анализа сшивки сайт DPC можно манипулировать, чтобы решить этот вопрос. Кроме того введение происхождения репликации в плазмиду DPC-подшипник может использоваться для решения влияние репликации на ремонт DPC. Кроме того может быть создано несколько сшивки плазмида изучить различия в ремонт одного DPC против нескольких сшивки. Это вопросы, которые будет трудно ответить, используя хромосомной ДНК, но легко может быть решена с помощью ГНПП ПЦР анализа. В целом, ГНПП ПЦР анализа требует очищенного, плазмида ДНК в количествах микрограмм, содержащий поражения известном месте. Аддукты Кроме DPC может использоваться в этом assay, однако, поражения должны быть способны блокирования расширение полимеразы Taq.

Protocol

1. поколение DPC-содержащих плазмиды Объединить 80 пмоль олигонуклеотида, содержащий 8-oxoguanine остатков (20 мкл) с 10 единиц T4 полинуклеотид киназы (1 мкл) в 10 x буфер лигаза (5 мкл). Добавьте воды, чтобы достичь суммарный объем 50 мкл и инкубировать при 37 ° C на 30 мин в ванну с подогретой водой. Объединить фосфорилированных олигонуклеотида (50 мкл), 80 пмоль одноцепочечной ДНК (80 мкл), полимеразы Taq 100 единиц (20 мкл) в 10 x Taq реакции буфера (25 мкл), АТФ 100 мм (20 мкл), дНТФ 10 мм (20 мкл), НЭБ буфера 2 (25 мкл) и 8 мкг BSA (20 мкл) в общей сложности 260 мкл. инкубировать образец в Термоциклер на 75 ° C в течение 15 мин, после чего 37 ° C за 5 мин. Далее, добавить 60 U T4 полимеразы (20 мкл), 8000 U T4 лигаза (20 мкл), 100 мм АТФ (20 мкл), дНТФ 10 мм (20 мкл), НЭБ буфера 2 (15 мкл) и 8 мкг BSA (20 мкл) в общей сложности 375 мкл. Инкубируйте реакции на ночь при 37 ° C (рис. 1A). Создание буфера насыщенный фенола: хлороформ смесь 50: 50. Добавить равных объемах каждого компонента, микс и спина в центрифугу столешница на 21,130 x g 5 мин хлороформ диски воду из буфера насыщенный фенола сформировать два слоя: верхний, водный слой и дно, органический слой. 375 мкл ниже, органический слой грунтовка расширения реакции, микс и спина в центрифугу столешница на 21,130 x g за 5 мин.Предупреждение: Фенола и хлороформа являются опасными веществами и должны приниматься меры предосторожности, избегать контакта с глазами и кожей. После центрифугирования тщательно извлечь верхний слой и смешать с Ацетат аммония, добавлен в конечной концентрации 0,3 м, следуют 2 тома 100% этанола. Хранят раствор при-20 ° C в течение минимум 30 минут или на ночь. Спиновые образец в центрифугу столешница на x 15000 об/мин при 4 ° C на 10 мин удалить супернатант и помыть лепешка в 1 мл 70% этанола. Спиновые образец в центрифугу столешница на x 15000 об/мин при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл воды. Смешайте 50 мкл ДНК из предыдущего шага с 16 мкл 6 x краситель гель загрузки, и 34 мкл воды и при условии электрофорез на агарозе низкой расплава 0,8% гель, содержащий бромид ethidium 0,5 мкг/мл. Побегите гель на 2 V/см на 10 см геля для 6 ч в 1 x TAE буфера. Акцизный supercoiled группы с помощью лезвия бритвы и весят гель ломтик (рис. 1A). Запуск положительный контроль в качестве маркера для которых мигрирует ковалентно закрытой, supercoiled ДНК.Предупреждение: Бромид Ethidium является мутагенным и должны приниматься меры предосторожности, избегать контакта с кожей. Кроме того важно свести к минимуму время, плазмиды образец подвергается воздействию УФ для того, чтобы уменьшить образование УФ фотопродуктов. Дайджест среза геля, добавляя 10% β-agarase реакция буфер для каждого мг геля веса. Инкубируйте на 65 ° C для 10 мин и охладить до 42 ° C. Добавить 10 U β-agarase и Инкубируйте на 42 ° C в течение 1 ч. Следующие инкубации, измерить объем и добавить Ацетат аммония в конечной концентрации 0,3 М и холод на льду на 15 мин центрифуги на 15000 x g 15 мин при комнатной температуре, собирать супернатант и добавить 2 тома изопропанола. Холод в-20 ° C на ночь. Центрифуга очищенный, supercoiled ДНК для 10 мин при 15 000 об/мин x в центрифугу столешница на 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 40 мкл воды. Пмоль (15 мкл) crosslink 12 дна до 36 пмоль oxoguanine glycosylase (в 1 мкл) в буфер, содержащий 100 мм NaCl (3 мкл), 1 мм MgCl2 (3 мкл), 20 мм трис-HCl рН 7,0 (6 мкл) и 10 мм натрия цианоборогидрида (2 мкл) для достижения окончательный объем 30 мкл при 37 ° C для 30 мин26. Удаление 1 мкл высокоструктурированные образца и разбавленных в 500 мкл воды в качестве 0 h данных точки и анализ на ПЦР на шаге 3. 2. kCl/SDS осадков Чтобы визуализировать сшивки эффективности, ограничение дайджест 1 мкг высокоструктурированные плазмида с 1 мкл Bspди в 10 x буфер при 37 ° C за 1 ч до создания двух разных размера фрагментов ДНК.Примечание: Один фрагмент будет высокоструктурированные белка (4.4 kb) и другие не будут (2.8 kB) (рис. 1B). Делить образцы в половине, добавить оба до конечной концентрации 0,5% SDS и Инкубируйте на 65 ° C для 10 мин. Добавить KCl (конечная концентрация 100 мм) к одному из образцов и инкубировать на льду на 5 мин. Центрифуга для обеих выборок на 12000 g x 5 минут при температуре 4 ° C и запустите supernatants на геле агарозы оценить процент спряжение белка до12ДНК.Примечание: KCl/SDS осадков используется для контроля качества, не подготовка субстрата. 3. transfection в клетки млекопитающих за 1 день до трансфекции, пластины 0,5 x 106 клеток/колодец в пластине 6-хорошо. Следующий день, смесь 1,5 мкг (30 мкл) DPC-содержащих плазмида (от шага 1.6) с 300 мкл сыворотки свободной культуры средств массовой информации. В другой трубки Смешайте 12 мкл Реагента transfection и 300 мкл сыворотки свободной культуры средств массовой информации. Объединить 300 мкл разбавленного ДНК с 300 мкл разбавленного трансфекции реагента и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. 250 мкл комплексов для каждого из двух скважин и инкубировать в течение не менее 1 ч при 37 ° C. После инкубации удалите СМИ, добавляют 1 мл 0,6% SDS/0.01 М ЭДТА и инкубации при комнатной температуре за 10-15 минут очистить ячейки, используя резиновыми полицейский и передать 1,5 мл отцентрифугировать. Добавить 200 мкл 5 М NaCl (конечная концентрация 1 м), инвертировать нежно 5 раз и Инкубируйте на 4 ° C ночь27. Центрифугуйте образцы на 21,130 x g в центрифугу столешница на 4 ° C на 30 мин, собирать супернатанта, осадок этанола, как описано выше и Ресуспензируйте в 50 мкл воды. 4. ГНПП ПЦР Смешайте 1 мкл восстановленные ДНК от каждого времени точки (включая 0 h), 2 x SYBR зеленый ПЦР главный микс (30 мкл), 27 мкл воды и 1 мкл (100 пмоль) грунтовки дополняет стренги ущерб плазмида (грунтовка R, рис. 2). Выполнять ПЦР с использованием следующих условий: Исходная предварительная расплава для 10 минут при 90 ° C, а затем 8 циклов: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 мин. В завершение цикла 8 добавить 1 мкл (100 пмоль) второй праймер для всего 60 мкл (грунтовка L, рис. 2)28 (см. Таблицу материалов для деталей реагента). Mix 1 мкл unamplified ДНК восстанавливаться в каждый момент времени (включая 0 h), 2 x главный микс (30 мкл), 27 мкл воды и 1 мкл каждого праймера (100 пмоль) в общей сложности 60 мкл. Загрузить 96-луночных ПЦР тарелку с образцами из шагов 4.1 и 4.2 (20 мкл/хорошо, в трех экземплярах) и выполнять ПЦР для 30 циклов, с использованием условий, описанных выше. Средние значения CT из каждого набора тройные образцов. Вычитание значения CT, созданного на шаге 4.1 от тех в шаге 4.2 для получения Дельта CT значение для каждого образца. Вычитание точки 0 h время из значения Дельта CT для удаления любой фон (см. Результаты представитель секции для подробного описания). Дельта CT значение преобразуйте в процент ремонт с использованием формулы:

Representative Results

Для того чтобы использовать ГНПП ПЦР анализа для оценки сотовых Ремонт DPC, должен быть подготовлен достаточное количество высокого качества DPC ремонт субстрата (мкг суммы). Чтобы получить этот продукт, олигонуклеотида, содержащий 8-oxoguanine остатков был отожженная для дополнительных одноцепочечной ДНК, грунтовка продлен и гель, очищенный обеспечить, что только ковалентно, закрытые круговой продукт был использован для transfections (Рисунок 1a). Настоящий доклад сосредоточен на субстратах, в которых боргидрид треппинг используется для создания ковалентный crosslink между рекомбинантного человеческого oxoguanine glycosylase и блок рибозы на молекулы двуцепочечной круговой плазмида, хотя аналогичные подходы может использоваться для получения химически различных субстратов DPC. Oxoguanine glycosylase/боргидрид треппинга стратегия является особенно привлекательным, учитывая чрезвычайно высокую эффективность реакции сшивания. Как показано на рисунке 1B, KCl/SDS осадков выполнена на подложке DPC, которые были осмыслены в двух фрагментов выборочно и количественно почти истощены фрагмента ДНК, укрывательство DPC. Эти результаты подтверждают вывод, что по существу 100% молекул субстрата плазмида содержат белок crosslink. Assay ГНПП ПЦР, описанные в разделе протокол использует значения CT, порожденных ПЦР для вычисления процентов DPC ремонта после transfection клеток млекопитающих. Как показано на рисунке 2 , белка crosslink блокирует полимеразы Taq от расширения грунтовка «R», отожженная DPC-содержащих strand. Во-вторых, критические особенностью этот assay является включение восьми раундов ПСПЭ реакций (используя праймер R) перед выполнением анализа ПЦР. Хотя неповрежденными (или отремонтированы) ДНК будет распространена в ходе этих реакций ГНПП, создание привязки сайта для вниз по течению «L» грунтовки, поврежденной ДНК (или неполно отремонтированы ДНК) не будут расширены. Следовательно ГНПП увеличивает обилие каждую прядь неповрежденными (или отремонтированы), восемь раз. Это означает, что ремонт образцы, в которых была выполнена ГНПП шаг до ПЦР будет отображаться значение CT, три единицы меньше, чем для идентичных образца, в котором ГНПП не была выполнена до ПЦР (рис. 2). 3 блок разница в значениях CT, наблюдается для двух лечения, именуемый ΔCT, отражает тот факт, что 8 = 23. Этот Дельта CT значение может использоваться для вычисления клеточной ДНК ремонта деятельность с использованием формулы: процент репарации ДНК = (2ΔCT /23) x 100. Управления эксперименты подтвердили, что дельта CT значение приблизительно 3 последовательно наблюдалось когда неповрежденных субстрата плазмид были подвергнуты ГНПП ПЦР (данные не показаны). Таблица 1 описывает пример CT значения, которые были получены от субстратов DPC-содержащих плазмиды, которые были оправилась от китайского хомяка легких фибробластов 3 ч. и 8 ч после трансфекции (Таблица 1А), а также от времени нулевой образцы, т.е., образцы, которые были подготовлены как описано в разделе протокол, но не transfected в клетки (Таблица1B). В таблице также приведены ΔCT, и процент ремонт значения (рассчитывается по формуле 2ΔCT/23 x 100) получил из этих образцов. Как показано в таблице 1А, процент ремонт, рассчитывается от образцов собирают 3 h и 8 ч после трансфекции был 66% и 93%, соответственно. Эти значения затем вычитается из которые получены от анализа 0 h образца для определения процента ремонта. Таблица 1В изображает CT значения для двух различных 0 h образцов, в которых эффективным сшивки был или не был достигнут до transfection. Эффективно высокоструктурированные образца привели к Дельта CT значение 0,8, тогда как образец плохо высокоструктурированные привели в дельте CT значение 2,5. До настоящего времени, не удалось точно определить источник 0.8 фонового сигнала в эффективно высокоструктурированные 0 h образца. Маловероятно, что этот фон отражает низкий уровень либо спонтанного удаления DPC, или это из-за низкого уровня Taq полимеразы «обойти» синтеза через DPC поражения: обширные эксперименты над высокоочищенных одноцепочечной M13 субстрата последовательно принесли Дельта CT значение приблизительно 0.8, то есть, по существу, идентична это «фон» расширение, видели в DPC-содержащих субстратов. Следовательно вполне вероятно, что существует небольшой степени неправильного грунтовки грунтовка «R» в ГНПП выполняемой приводит поколения небольшое количество продукта, который впоследствии может быть усилена при добавлении грунтовка «L» и ПЦР. Усилия по ликвидации этого фона, изменяя условия PCR у, до настоящего времени, не удалось исправить этот дефект. Однако вычитание стратегии, описанные выше позволяет точную оценку деятельности ремонт DPC. Это стоит отмечая, что неэффективная сшивки белка на плазмида приведет к повышенной фоновую. Это изображен образец данных, представленных в таблице 1В где неэффективных протеин дна сшивки привело к выше Дельта CT значение для времени 0. Таким образом управления являются неизменно эксперименты до начала transfections и субстратов с дельта CT значения возвышаясь над 0,8, пороговый уровень, отбрасываются. Как указано в протоколе ПЦР, каждый образец состоит из 3 скважины для обеспечения согласованности дозирования. Эти реплицирует затем усредняются для получения значения CT для этого образца. Реплицирует что отклоняться более чем на ± 0,1, исключаются из набора данных. Если все три реплицирует отклоняться более чем на ± 0,1 друг от друга, ГНПП ПЦР анализа переделано, до тех пор, пока последовательного значения получаются. Опыт показывает, что по крайней мере 3 независимых transfections должны быть выполнены для получения надежного средние значения, которые затем могут быть подвергнуты статистический анализ, чтобы определить влияние различных параметров на эффективность ремонта DPC. Рисунок 1. Поколение DPC-содержащих плазмида. (A) олигонуклеотида, содержащий 8-оксо гуаниновых остатков (красный) отожженная одноцепочечной ДНК (жирным черным кружком) и расширен для создания двунитевая плазмида (грунтовка расширение продукта обозначается пунктирной линией). После электрофореза в бромид ethidium группа, соответствующая supercoiled ДНК (красный прямоугольник) вырезан из геля агарозы низкой расплава и переваривается с β-agarase. Переулки: (1) молекулярный вес маркер, (2) одноцепочечной ДНК, (3) double-stranded дна, расширенный образец (4) грунт. (B) Oxoguanine glycosylase (сокращенно hOGG1, изображается как оранжевый круг) является crosslinked к 8-оксо гуаниновых остатков через натрия цианоборогидрида и полученный субстрат DPC переваривается для генерации 2,800 база пара, бесплатный фрагмент ДНК и 4400 база пара фрагмент придает белка. SDS добавляется в образец, который затем делится на две части, одна из которых обрабатывается с KCl и центрифугируют отложениях DPC-содержащих ДНК (изображается как оранжевый гранул). Супернатант от этой последней примеры (изображается как голубая жидкость в пластиковых пробирок) и не подвержены KCl подвергаются электрофореза геля. Переулки: маркер молекулярного веса (1), (2) -KCl, (3) + KCl. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: количественная оценка поврежденных плазмида через ГНПП ПЦР. Денатурировано плазмида ДНК и грунт, в дополнение к поврежденной strand (R) отожженных и расширенные. Этот процесс повторяется для в общей сложности 8 циклов. С поврежденной субстрата (вверху) полимеразы Taq блокируется DPC поражения и не будет производить полную длину прядей продукта. Напротив с восстановленной субстрата (внизу), полимеразы Taq будет производить полноценный продукт пряди, содержащий привязку сайта для грунтовки л После 8 циклов грунтовка L добавляется, и цикл пороговые значения определяются с помощью ПЦР. Пример результатов амплификации для поврежденных и неповрежденные субстратов проиллюстрированы справа красная линия, представляющая ДНК, который перенес выдвижение праймера до ПЦР и синий, представляющие ДНК, который не был продлен до ПЦР грунт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Таблица 1а Время -Расширение грунт + Расширение грунтовка Δ CT Процент ремонт (2ΔCT/23x 100) 3 h 23.5 21.1 2.4 66 8 h 29,4 26.5 2.9 93 Таблица 1В Время -Расширение грунт + Расширение грунтовка Δ CT Процент фон (2ΔCT/23x 100) 0 h 15.4 14,6 0,8 22 0 h 15.4 12,9 2.5 71 Таблица 1: расчет процента ремонта с помощью КТ значения, полученные из ГНПП ПЦР. (A) ремонт DPC-содержащих субстрата transfected в V79 китайского хомяка легких фибробластов 3 ч. и 8 ч после transfection. (B) ГНПП ПЦР 0 h образцов не transfected в клетки. В одном образце эффективность реакции сшивки между ДНК и oxoguanine glycosylase была высокой (в этом образце дало низкий Дельта CT) во время в другой образец эффективности белка сшивки был низким (в этом примере принесли сравнительно высокой Дельта Значение, CT). Увидеть текст Представитель результаты для деталей.

Discussion

Метод ПЦР ГНПП предлагает многочисленные преимущества по сравнению с другими подходами путем изучения ремонт однородного населения, содержащий один, определенный DPC поражения. Примечательно, что помимо управления идентификатор типа химических crosslink, используется для соединения с белками на ДНК и белка, это можно легко манипулировать контекст последовательность, в которую вводится DPC поражения. Мы изучили влияние на ремонт DPC представляя поражения либо шаблон или кодирования стренги плазмида вниз по течению активного активаторных Локус. Аналогичным образом мы находимся в процессе изучения влияния на ремонт DPC репликации, используя M13 плазмиду, содержащий SV40 происхождения репликации transfected в HEK293T клетки. Assay описаного непосредственно ремонт DPC меры, в отличие от других стратегий, таких как принимающей ячейки реактивации что косвенно смета ремонта деятельность24,25. Кроме того система является надежной, чувствительной и количественные. В отличие от других систем, которые измеряют удаления DPC, этот assay обнаруживает только капитальный ремонт события, то есть, она требует не только исключить DPC поражения, но что целостность дуплекс ДНК быть полностью восстановлен17. Это потому что abasic сайты и Ники или перерывы в основу Фосфодиэфирная блокировать assay так же эффективно, как оригинальные DPC поражения29.

Хотя настоящий доклад сосредоточен на определенного типа КВП, который был создан боргидрид треппинга ферментных реакций промежуточного, в настоящее время мы разрабатываем подходов для изучения ремонт DPC, с участием других белков и поражения в котором связь белка ДНК происходит через базу нуклеозидов, а не позиции рибозы. С помощью восстановительного аминирования, мы создали белков и пептидов сшивки, прикрепленные к гуанин или цитозин базы ДНК грунтовка30. Эти олигонуклеотиды были очищены до однородности и используется для создания supercoiled плазмид, содержащих ДНК белков и ДНК пептид сшивки. В то время как эффективность этих реакций несколько снизился по сравнению с oxoguanine glycosylase crosslink подход подробно выше, они тем не менее были успешными и разрешение на изучение ремонт этих субстратов в одичал тип и нуклеотидов иссечение ремонт недостаточным mammalian клетки линии. Мы также использовали ГНПП ПЦР-анализа для изучения ремонт повреждений oxoguanine и синтетических рибозы холестерин конъюгата, который ранее был показан восстанавливаемого через сотовой нуклеотидов иссечение ремонт техники31. Как графически изображена на рисунке 2 , ремонт любых поражения что выдвижение праймера блоков, полимеразы Taq может в принципе, измеряться с помощью ГНПП ПЦР анализа.

Текущие модели DPC ремонта предположить, что больше DPC (> 10 кДа) подвергаются протеолитических обработки небольших пептидных поражением до удаления32,,3334. Являются наиболее вероятными кандидатами ответственных за этот протеолиза протеасомы или конкретных протеазы в клетках человека, под названием Spartan20,21,,3536,37, 38. дальнейшие расследования роли этих протеаз может проводиться с использованием ГНПП ПЦР анализа. Ингибиторы протеасом может использоваться для предварительной обработки клеток до трансфекции с DPC-содержащих субстратов. В качестве альтернативы спартанский нокдаун клеточных линий может transfected с поврежденной плазмиды для уточнения его роли в протеолиза больших DPC.

Независимо от метода, используемого для создания crosslink или характера поражения ДНК это следует подчеркнуть, что методология ГНПП ПЦР критически зависит способность генерировать значительное количество однородных DPC-плазмида субстрата. Шагов, необходимых для этого анализа включают очистки ковалентно, закрытые циркуляр плазмида после выдвижение праймера для устранения любого порезал или линейных плазмид молекул. Эти загрязняющие вещества должны быть ликвидированы для обеспечения того, чтобы любой последующий ремонт DPC наблюдается не за счет процессов режиссер Ник или двухручьевой брейк направленных ремонт. Неполучение достаточного количества supercoiled ДНК, после грунтовки расширения реакции могут быть преодолены путем изменения соотношения олигонуклеотида одноцепочечной ДНК. Еще один важный шаг для метода ГНПП ПЦР-сшивки эффективность белка для плазмида. В этом исследовании, эффективный, ферментативные реакции был использован чтобы crosslink белка glycosylase oxoguanine 8-оксо гуанин поражением. Югу оптимального сшивки может быть улучшено, изменяя количество белка, добавил к реакции.

Хотя результаты, описанные в настоящем докладе полагались на липофекция представить DPC ремонт субстратов в получателей клетки, нет никаких оснований, априори, другие transfections методы не могут быть использованы. Мы провели предварительных исследований и отметил, что электропорации39 может также использоваться. Однако стоит отметить, что наш опыт, эффективность трансфекции электропорации снижается по сравнению с липофекция, и мы сочли необходимым использовать ДНК перевозчика (до 5 мкг) в дополнение к 1,5 мкг DPC субстрат для получения данных ремонт. В целом описанным выше способом ГНПП ПЦР обеспечивает инновационный способ исключительно изучить DPC ремонт на плазмидной ДНК и создавать новое понимание ответ повреждения ДНК.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась национальных институтов здравоохранения (ES023350). Лиза Chesner поддерживается обучения Грант 5T32HL007741. Мы благодарим, Наталья Третьякова (Университет Миннесоты) и Ашис басу (Университет штата Коннектикут) и их члены лаборатории для поддержки и технических консультаций в начале и промежуточных этапов этой работы.

Materials

8-oxoguanine modified oligo Midland Certified Reagent Company NA Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’
T4 PNK NEB M0201S
Single-stranded M13 NEB N4040S
Taq polymerase NEB M0267L
ATP, 100mM Thermo Scientific R0441
dNTP Mix, 10mM each Thermo Scientific R0192
BSA NEB B9001S
T4 polymerase NEB M0203L
T4 ligase NEB M0202L
β-agarase NEB M0392S
Oxoguanine glycosylase 1 NEB M0241S
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4309155 green PCR master mix
Primer R UMN Genomic Center NA 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’
Primer L UMN Genomic Center NA 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-012 transfection reagent 
BspD1 NEB R0557S
NEB buffer 2 NEB B7002S
StepOnePlus Real Time PCR System Applied Biosystems 4376600
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
Chloroform, reagent ACS, spectro grade ACROS 40463-5000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  2. Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
  3. At Groehler, A. t., Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
  4. Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
  5. Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
  6. Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
  7. Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
  8. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
  10. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
  11. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
  12. Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
  13. Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
  14. Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
  15. Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
  16. Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
  17. Groehler, A. t., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
  18. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  19. Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
  20. Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  21. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
  22. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  23. Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
  24. Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
  25. Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
  26. Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
  27. Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
  28. Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
  29. Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
  30. Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
  31. George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
  32. Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
  33. Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
  34. Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
  35. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  36. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  37. Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
  38. Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
  39. Potter, H., Heller, R., Ausubel, F. M. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. , (2003).

Tags

DNA-protein CrosslinksPlasmid DNAMammalian CellsDNA RepairTrans-Pacific Primer Extension QPCR AssayAdductsPolymerase BlockingHouse Cell Reactivation8-oxoguanineT4 Polynucleotide KinasePrimer ExtensionPhenol-chloroform Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chesner, L. N., Campbell, C. A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (133), e57413, doi:10.3791/57413 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image