Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.
Diese Methode soll bieten eine flexible, schnelle und quantitative Technik um die Kinetik der DNA-Protein Crosslink (DPC) Reparatur in Säugetieren Zelllinien zu untersuchen. Dieser Assay untersucht anstatt weltweit prüfen Entfernung der Harnblase-induzierte oder spontane chromosomalen DPC-Entfernung, die Reparatur einer homogenen, chemisch definierte Läsion, die speziell an einem Standort in einem Plasmid DNA Substrat eingeführt. Wichtig ist, ist dieser Ansatz vermeidet die Verwendung radioaktiver Stoffe und ist nicht abhängig von teuren oder hoch spezialisierte Technologie. Stattdessen verlässt sich auf standard rekombinanter DNA-Verfahren und weithin verfügbar in Echtzeit, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Instrumentierung. Aufgrund der inhärenten Flexibilität der Strategie genutzt, die Größe des Proteins vernetzt, sowie die Natur der chemischen Bindung und die präzise DNA kann Sequenz Kontext des Standortes Anlage variiert werden, um die jeweiligen Beiträge dieser Adresse Parameter, um die Gesamteffizienz des DPC-Reparatur. Mit dieser Methode wurden Plasmide enthält eine ortsspezifische DPC in Zellen transfiziert und niedermolekularen DNA erholt zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion. Dann wird wiederhergestellte DNA Strang-spezifische Primer Extension (SSPE) mit einer Grundierung, die komplementär zu den beschädigten Strang des Plasmids unterzogen. Seit die DPC Läsion Blöcke Taq-DNA-Polymerase kann das Verhältnis von reparierten, UN-reparierte DNA quantitativ mit qPCR beurteilt werden. Zyklus (CT) Grenzwerte dienen zum berechnen, dass Prozent zu verschiedenen Zeitpunkten in den jeweiligen Zelllinien zu reparieren. Diese SSPE-qPCR-Methode kann auch zur quantitativ bewerten die Reparatur Kinetik DNA-Addukt, dass Blöcke Taq Polymerase.
Hier beschriebenen wird eine PCR-basierter Test SSPE-qPCR bezeichnet. Der Zweck dieser Methode ist, DPC-Reparatur auf Plasmid zu quantifizieren, die DNA in Reparatur mangelhaft und tüchtig Säugerzellen transfiziert. Dieser Assay ist rasche, quantitative, extrem flexibel und direkt Maßnahmen reparieren Aktivität. Während dieser Bericht konzentriert sich auf die Verwendung dieser Methode zur Reparatur von DPCs studieren, veranschaulichen Ergebnisse dargestellt, dass eine Reparatur einer Läsion, blockiert, die Taq Polymerase mit dieser Methodik untersucht werden kann.
Die Beweggründe für die Entwicklung dieser Methode ist es, Einblick in die Mechanismen, durch die Säugerzellen DPCs reparieren. Im Gegensatz zu anderen Arten von DNA-Schäden sind DPCs massiv diverse1,2. Studien haben gezeigt, dass Hunderte von zellulären Proteinen vernetzt zu DNA und das für jedes Protein gibt es in der Regel zahlreiche Aminosäure-Seitenketten werden können, das kovalent an zelluläre DNA3angebracht werden kann. Darüber hinaus gibt es zahlreiche chemische Befestigungspunkte für Proteine auf das DNA-Rückgrat, darunter mehrere Positionen auf der Nukleotidbasen sowie auf die Ribose Zucker4,5. Diese chemische Vielfalt wirft die Aussicht, der unterschiedliche biochemische Stoffwechselwege herangezogen werden können, um verschiedene Arten von DPCs zu reparieren. Es war mit diesem Anliegen im Auge, dass die SSPE-qPCR-Assay entwickelt wurde.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um einen Einblick in die Molekularbiologie der DPC Zellreparatur. Im folgenden finden einer Übersicht über die wichtigsten Ansätze, die, mit einer Zusammenfassung der wichtigsten Stärken und Schwächen entwickelt wurden, jeder besitzen. Es ist hervorzuheben, dass während dieser Zusammenfassung konzentriert sich auf Studien der DPC-Reparatur in Säugetieren Zellkultursysteme, bedeutende Beiträge zum aktuellen Modell der DPC Reparatur vorgenommen worden mit mikrobiellen und zellfreien Systemen, die nicht in diesem diskutiert werden Manuskript.
Vielleicht ist die einfachste Strategie, die ergriffen werden, um einen Einblick in die Genetik der DPC Reparatur zur Bewertung der jeweiligen Empfindlichkeit zum Zelltod im Wildtyp und mutierten Zellen, Agenten, die DPCs6,7induzieren beobachtet. Diese Strategie ist relativ schnell, kostengünstig und erfordert keine Spezialwissen über die Fähigkeit, grundlegende Zelle Kulturtechniken durchzuführen. Gegengewicht zu diesen Vorteilen sind zahlreiche Beschränkungen dieses Ansatzes, einschließlich der folgenden. Der Test misst zunächst nicht direkt DNA-Reparatur. Die Arbeitshypothese, die hinter dieser Strategie ist, dass Inaktivierung Mutationen in Genen Codierung entsprechenden DNA-Reparatur-Proteine führt zu einer Anhäufung von DNA, dass Trigger programmierten Zelltod beschädigen. Jedoch könnte, Mutationen in Genen, die DNA-Reparatur-Proteine codieren prinzipiell verbessern (zelluläre Empfindlichkeit in xenobiotische-induzierte Zelltod oder reduzieren). Zweitens, Agenten, die ausnahmslos DPCs erstellen induzieren andere Arten von DNA-Schäden (eine Ausnahme ist 5-Aza-2′-Deoxycytadine, aber dieses Mittel verbraucht auch zelluläre Methyltransferase Level8). Infolgedessen ist es denkbar, dass verstärkte zelluläre Überempfindlichkeit gegenüber der betreffenden Agent Mängel in der Reparatur von interstrand Querverbindungen oder andere Läsionen widerspiegeln kann. Drittens stehen wie oben erwähnt wurde, DPCs eine stark heterogene Klasse bestehend aus verschiedene Arten von chemischen Querverbindungen mit verschiedenen Protein-Partnern. Es ist möglich, dass während der Reparatur von einem oder mehreren Untertypen dieser Läsionen in einem bestimmten genetischen Hintergrund geändert werden kann, dieser Unterschied wesentlich verändern zelluläre Überempfindlichkeit gegen Tod infolge dieser Agent möglicherweise nicht ausreichen. Zusammenfassend lässt sich sagen während diese Strategie einen attraktiven Ausgangspunkt darstellt unterstreichen die oben beschriebenen Einschränkungen die Bedeutung andere, direkte Methoden zur Untersuchung der Kinetik der DPC-Reparatur zu verfolgen.
Eine Reihe von damit verbundenen Ansätzen wurden entwickelt, um dieses Ziel zu erreichen. Ermittler haben beispielsweise Methoden zur Unterscheidung zwischen “freien” DNA und Protein gebundene DNA-9,10,11entwickelt. Mit diesen Ansätzen ist es möglich, stationäre DPCs oder folgenden Exposition gegenüber einem DPC-produzierende Erreger in verschiedene genetische Hintergründe vergleichen. Die beiden Strategien, die am weitesten verbreitete beinhalten freie DNA mit einem Nitrozellulose-Membran verbindliche Strategie oder KCl/SDS Niederschlag12,13DPC-haltigen DNA trennt. In der ehemaligen Ansatz sind Zellen lysiert und durch eine Nitrozellulose-Filter geleitet. Da Nitrozellulose Protein bindet, behält der Filter Protein-chromosomale DNA, erlaubt freien DNA zu durchqueren. In der letzteren Strategie ist freie DNA Protein-gebundenen DNA getrennt, beruht auf der Tatsache, dass SDS an Proteine aber nicht DNA bindet und durch die Zugabe von KCl ausgefällt werden kann. Infolgedessen wird Protein-chromosomale DNA unlöslich, während ungebundenen DNA in Lösung bleibt. DPC-haltigen DNA kann dann quantitated mit radioaktiven Thymidin (wenn Zellen zunächst metabolisch gekennzeichnet wurden) oder durch einen DNA-selektive Fluoreszenzfarbstoff wie Hoechst 33258. Diese Methoden sind reproduzierbar und benötigen eine kleine Anzahl von Schritten. Jedoch bieten sie keine Informationen über die Natur der chemischen Crosslink durch die Protein DNA zugeordnet ist. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, diese Tests können überschätzen, DPC fälschlich erzielte unvollständig Reparatur, d.h.proteolytische Verarbeitung bis hin zur kleineren DNA-Peptid-Querverbindungen, die möglicherweise nicht so leicht gefangen oder, als bona fide DNA ausgefällt zu reparieren zu reparieren.
Comet-Assays lässt sich DPC Bildung in Zellen14zu visualisieren. In diesen Experimenten verringern das Vorhandensein von DPCs DNA-Migration kann dann durch Vorbehandlung mit Proteinase K. umgekehrt werden Daher kann die Länge der Rute zur DPC-Bildung zu schätzen. Wie oben erwähnt, erstellen DPC-forming Drogen jedoch andere Arten von DNA-Schäden, die Schwanzlänge verändern könnte. Dieses Protokoll ist auch hochtechnische und erfordert Erfahrung und Ausbildung in der konfokalen Bildgebung.
Massenspektrometrie kann verwendet werden, um DPC Reparatur Kinetik nach der Behandlung mit Vernetzung Agenten15,16,17zu studieren. Diese Experimente Zellen mit DPC-bildenden Mitteln zu behandeln und DPCs über Biotin erfassen oder Phenol: Chloroform (1:1) Extraktion zu isolieren. Massenspektrometrie kann dann verwendet werden, zu identifizieren die vernetzte Proteine oder quantitate die Höhe der DPCs im Laufe der Zeit gebildet. Der große Vorteil dieses Ansatzes ist die Natur der erstellten Daten. Es ist möglich, Katalog genau die Arten von Proteinen, die nach Exposition gegenüber einem Fremdstoff, jedoch dieses Protokoll vernetzt werden ist teuer, zeitaufwändig und wird begrenzt durch die Art der Crosslink, die erkannt werden können.
Maizels Et Al. entwickelt einen sensible “RADAR” (rapid Ansatz DNA-Addukt Erholung) Assay, quantitate Immunodetection DNA-Protein-Addukte sowie ein ELISA-basierten RADAR Assay18,19. Diese Tests eignen sich besonders für trapping DNA-Protein-Zwischenprodukte, die vorübergehend in den Zellen bilden und erzeugen Proben geeignet für Massenspektroskopie, neue Proteine zu identifizieren Addukte. Dieser Immunodetection-Assay stützt sich auf die Verfügbarkeit von Antikörpern, die DNA-Protein-Crosslink zu erfassen und daher möglicherweise nicht in der Lage erkennen geschädigter DNA-Peptid Addukte bilden während der Reparatur. Vor kurzem, eine spezifische DPC reparieren Weg zur DNA-Replikation und eine DNA-abhängige Metalloprotease entdeckte Spartan Proteolyzed, kleinere Peptide während Reparatur20,21in welche DPCs sind verbunden. Vererbte Mutationen in diesem Gen sind mit Ruijs-Aalfs-Syndrom beim Menschen eine Krankheit gekennzeichnet durch genomische Instabilität, vorzeitiger Alterung und Leberkrebs22. Mäuse mit gentechnisch Spartan Gendefekten anzeigen ähnlichen Phänotypen23
Wirtszelle Reaktivierung der transkriptionelle Aktivität wurde verwendet, um die Reparatur von definierten Läsionen auf transfizierten Plasmid DNA-Substrate24,25zu studieren. In diesen Experimenten, Plasmid DPCs (oder andere Arten von DNA-Läsionen) enthalten, die die Transkription eines Reporters, wie z. B. Luciferase zu blockieren, sind in Zellen transfiziert. Lumineszenz-Messungen genommen 24-72 h später sind dann korreliert mit DPC zu reparieren. Jedoch diese indirekte Reparatur Assays sind nicht in der Lage frühestens 24 h nach Transfektion Reparatur Ereignisse zu erkennen und können nicht unterscheiden zwischen RNA-Polymerase Bypass teilweise reparierte Substrate und vollständige Reparatur.
Jede der oben beschriebenen Methoden hat Vorteile und hat dazu beigetragen, das aktuelle Modell der DPC-Reparatur. Jedoch die SSPE-qPCR-Assay umgeht einige der Einschränkungen verbunden mit diesen anderen Ansätzen und folglich bieten genauere Einblicke in DPC Reparaturmechanismen. Beispielsweise kann die SSPE-qPCR-Assay Reparatur von standortspezifischen DPCs auf DNA in intakten Säugerzellen direkt messen. Diese Methode ist vielseitig und wurde verwendet, um nach Transfektion in Hamster und humanen Zelllinien Reparatur-Ergebnisse zu erhalten. Transfektion des Plasmids kann mit Lipofektion oder Elektroporation in kultivierten Säugetierzellen Linien durchgeführt werden. Es wird auch sichergestellt, dass nur Reparatur von definierten DPCs wird gemessen, und nicht andere Arten von DNA-Schäden durch die meisten DPC-bildende Mittel induziert. Die SSPE-qPCR ist einfach durchzuführen, kostengünstig und schnell. Erzielten Ergebnisse mit dieser Assay haben bereits 2 h nach Transfektion Reparatur Ereignisse erkannt. Mit dieser Methode, können Variablen, die DPC-Reparatur-Ergebnisse beeinflussen können in einer Art und Weise untersucht werden, die sensible und effizient ist. Zum Beispiel hat die Rolle der Transkription in DPC Reparatur noch streng bewertet werden. Aufgrund der Flexibilität der SSPE-qPCR-Assay kann Ortsbild Vernetzung des der DPC manipuliert werden, um mit dieser Frage beschäftigen. Einführung der Herkunft der Replikation in der DPC-Lager-Plasmid ist darüber hinaus lässt sich den Einfluss der Replikation auf DPC Reparatur Adresse. Darüber hinaus können mehrere Querverbindungen auf dem Plasmid zu prüfen, Unterschiede in der Reparatur von einem einzigen DPC gegen mehrere Querverbindungen erstellt werden. Das sind Fragen, die schwer zu beantworten, mit der chromosomalen DNA wäre aber leicht mit der SSPE-qPCR-Assay angesprochen werden können. Insgesamt die SSPE-qPCR-Assay erfordert gereinigt, Plasmid-DNA in Mikrogramm-Mengen mit einer Läsion von einem bekannten Speicherort. Addukte neben DPC in diesem Assay verwendet werden kann, die Läsion muß jedoch in der Lage, die Erweiterung von Taq Polymerase blockiert.
Die SSPE-qPCR-Methode bietet zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Ansätzen durch die Untersuchung der Reparatur einer homogenen Bevölkerung mit einer einzelnen, definierten DPC-Läsion. Es ist bemerkenswert, dass neben der Steuerung der Identität des Proteins und die Art der chemischen Crosslink verwendet, um das Protein an die DNA zu verbinden, es möglich ist, leicht Sequenz Rahmen manipulieren die DPC-Läsion eingeführt. Wir haben den Einfluss auf die DPC-Reparatur von Einführung der Läsion auf entweder die Vorlage oder Codierung Strang ein Plasmid flussabwärts eine aktive Promoter Locus untersucht. Ebenso sind wir bei der Untersuchung des Einfluss auf die DPC-Reparatur von Replikation mit einem M13 Plasmid enthält einen SV40-Ursprung der Replikation in HEK293T Zellen transfiziert. Der Test beschriebenen hier direkt Maßnahmen DPC Reparatur, im Gegensatz zu anderen Strategien wie Host Zelle Reaktivierung, dass indirekt Schätzungen Aktivität24,25reparieren. Darüber hinaus ist das System robust, sensibel und quantitative. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die DPC-Entfernung zu messen, dieser Test erkennt nur vollständige Reparatur Ereignisse, d. h., es erfordert nicht nur, dass die DPC-Läsion entfernt werden, sondern, dass die Integrität der duplex DNA vollständig werden17wiederhergestellt. Und zwar deshalb, weil abasic Standorte und Kerben oder Pausen im Phosphodiester-Rückgrat den Test so effektiv wie die ursprüngliche DPC Läsion29blockieren.
Während dieser Bericht konzentriert sich auf eine bestimmte Art von DPC, die von Natriumborhydrid Trapping von einer Enzymreaktion Mittelstufe erstellt wurde, entwickeln wir derzeit Ansätze zur Reparatur der DPCs mit anderen Proteinen und Läsionen in der Studie die Protein-Bindung an die DNA erfolgt durch die Nukleosid-Basis, anstatt die Ribose-Position. Mit reduktive Aminierung, schufen wir Proteine und Peptide vernetzt am Guanin oder Cytosin Basis einer DNA-Primer-30. Diese Oligonukleotide wurden gereinigt, Homogenität und zur Erzeugung von supercoiled DNA-Protein und DNA-Peptid Querverbindungen mit Plasmiden. Während die Effizienz dieser Reaktionen im Verhältnis zu dem oben ausführlich beschriebene Oxoguanine Glycosylase Crosslink Ansatz etwas reduziert wird, sie waren jedoch erfolgreich und ermöglichen die Prüfung der Reparatur dieser Substrate in Wildtyp und Nukleotid Exzision Reparatur-defizienten Säugetieren Zelllinien. Wir haben die SSPE-qPCR-Assay genutzt, um die Reparatur von Oxoguanine Läsionen und eine synthetische Ribose-Cholesterin-Konjugat, die bisher gezeigt wurde, über die zelluläre Nukleotid Exzision Reparatur Maschinen31repariert werden zu untersuchen. Wie Abbildung 2 grafisch zeigt, reparieren Sie jede Läsion, dass Blöcke Grundierung Erweiterung von Taq Polymerase im Prinzip mit SSPE-qPCR-Assay gemessen werden kann.
Aktuelle Modelle der DPC Reparatur legen nahe, dass größere DPCs (> 10 kDa) proteolytische Verarbeitung zu kleineren Peptid-Läsion vor Entfernung32,33,34ausgesetzt sind. Verantwortlich für diese Proteolyse wahrscheinlichste Kandidaten sind das Proteasom oder eine spezifische Protease in menschlichen Zellen namens Spartan20,21,35,36,37, 38. weitere Untersuchungen über die Rollen von diese Proteasen mit der SSPE-qPCR-Test durchgeführt werden können. Proteasom-Inhibitoren könnte verwendet werden, um die Zellen vor Transfektion mit DPC-haltige Untergründe vorbehandeln. Alternativ könnte Spartan Knockdown Zelllinien mit beschädigten Plasmide, seine Rolle bei der Proteolyse von größeren DPCs aufzuklären transfiziert werden.
Unabhängig von der Methode verwendet, um die Crosslink zu erstellen oder die Natur der DNA-Läsion ist es hervorzuheben, dass die SSPE-qPCR-Methodik entscheidend von der Fähigkeit ist, erhebliche Mengen an homogenen DPC-Plasmid Substrat zu erzeugen. Schritte notwendig, für diese Analyse gehören Reinigung der kovalent, geschlossen-kreisförmigen Plasmid nach Grundierung Ausdehnung um irgendwelche geklaut zu beseitigen oder linear Plasmid Moleküle. Diese Verunreinigungen müssen beseitigt werden, um sicherzustellen, dass Nachbesserung DPC beobachtet unter der Regie von Nick oder Doppel-Strang unter der Regie von Pause Reparaturprozesse nicht zusteht. Mißerfolg, ausreichende Mengen von supercoiled DNA nach Grundierung Erweiterung Reaktionen erhielt kann überwunden werden, durch das Verhältnis von Oligonukleotid-einzelsträngige DNA Variation. Ein weiterer wichtiger Schritt für die SSPE-qPCR-Methode ist die Vernetzungseffizienz des Proteins, das Plasmid. In dieser Studie wurde eine effiziente, enzymatische Reaktion verwendet, Crosslink Oxoguanine Glycosylase Protein, ein 8-Oxo-Guanin-Läsion. Sub-optimale Vernetzung kann verbessert werden, indem man die Menge des Proteins hinzugefügt, um die Reaktion.
Während die Ergebnisse in diesem Bericht beschriebenen verlassen sich auf Lipofektion, DPC Reparatur Substrate in Empfängerzellen einzuführen, es gibt keinen Grund, a-priori, andere Transfektionen Methoden nicht eingesetzt werden konnte. Wir haben Voruntersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass Elektroporation39 auch genutzt werden kann. Aber es ist erwähnenswert, dass nach unserer Erfahrung, Elektroporation Transfection Leistungsfähigkeit sinkt im Vergleich zu Lipofektion und fanden wir es notwendig Träger DNA (bis zu 5 µg) zusätzlich zu den 1,5 µg DPC Substrat verwenden, um Reparaturdaten zu erhalten. Insgesamt bietet die oben beschriebene SSPE-qPCR-Methode eine innovative Möglichkeit, ausschließlich DPC Reparatur auf Plasmid DNA zu untersuchen und neue Einblicke in die DNA-Schäden-Reaktion zu erzeugen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (ES023350) finanziert. Lisa Chesner unterstützt Ausbildung Grant 5T32HL007741. Wir danken Natalia Tretyakova (University of Minnesota) und Ashis Basu (University of Connecticut) und ihre Lab-Mitglieder für die Unterstützung und Beratung während des frühen und Zwischenstufen dieser Arbeit.
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |