המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.
מטרת שיטה זו היא לספק שיטה כמותית, מהירה גמישות כדי לבחון את קינטיקה של חלבון-דנ א תיקון crosslink (DPC) בקווים בתרבית של תאים. במקום באופן גלובלי assaying הסרה של xenobiotic-induced או ספונטנית להסרת DPC כרומוזומלית, וזמינותו הזה בוחן את התיקון של פצע הומוגנית, הגדרה כימית הציג באופן ספציפי באתר אחד בתוך מצע דנ א פלסמיד. חשוב, גישה זו מונע את השימוש בחומרים רדיואקטיביים ואינה תלויה יקר או שהתשתית טכנולוגיות. במקום זאת, הוא מסתמך על הליכים סטנדרטיים דנ א רקומביננטי ומכשור תגובת שרשרת (qPCR) הנפוצה פולימראז בזמן אמת, כמותית. בהתחשב הגמישות של האסטרטגיה מנוצל, בגודל של החלבון תפור, כמו גם את טבעו של הצמדה כימי של ה-DNA מדויק רצף בהקשר של האתר המצורף יכולים להיות מגוונים לכתובת תרומות בהתאמה של אלה פרמטרים היעילות הכוללת של DPC תיקון. באמצעות שיטה זו, פלסמידים המכיל DPC בייעודי לאתר היו transfected לתוך תאים ושוחזר נמוך משקל מולקולרי דנ א שונים פעמים שלאחר תרביות תאים. DNA התאושש ואז נענשים הארכת תחל ספציפיים סטרנד (הצהבת) באמצעות פריימר משלימים לחוף פגום של פלסמיד. מאז DPC הנגע בלוקים Taq DNA פולימראז, היחס של DNA לתיקון כדי לא תוקן יכול להיות באופן כמותי מוערך באמצעות qPCR. ערכי הסף (CT) מחזור משמשים לחישוב אחוז לתקן בנקודות זמן שונות בשורות תאים המתאימים. שיטה זו הצהבת-qPCR יכול לשמש גם כדי להעריך באופן כמותי את התיקון קינטיקה של דנ adduct את רחובות אנזימים.
כפי שיתואר בהמשך assay המבוסס על ה-PCR הנקרא הצהבת-qPCR. מטרת שיטה זו היא לכמת DPC תיקון על פלסמיד ש-DNA transfected תיקון לקוי ומיומן בתרבית של תאים. זה וזמינותו היא מהירה, כמותיים, גמיש במיוחד, ותיקון ישירות אמצעים פעילות. בעוד דוח זה מתמקד בשימוש מתודולוגיה זו ללמוד תיקון ה-Dpc, תוצאות שיובאו להלן ממחישים את התיקון של כל הנגע החוסמת. אנזימים יכולים להילמד באמצעות מתודולוגיה זו.
הרציונל מאחורי הפיתוח של שיטה זו הוא להשיג תובנה המנגנון שדרכו תאים בתרבית של תיקון Dpc. בניגוד לסוגים אחרים של נזק לדנ א, קריאות Dpc הן מגוונות בנפט1,2. מחקרים הראו כי מאות החלבונים יכול להיות תפור ל- DNA ואת זה עבור כל חלבון יש, באופן עקרוני, רבים שרשראות צד חומצת אמינו יכול להיות מצורפת covalently DNA הסלולר3. בנוסף, ישנן נקודות רבות מצורף כימי חלבונים על גבי עמוד השדרה ה-DNA, כולל מספר תנוחות על הבסיסים נוקלאוטיד, כמו גם על ה4,סוכר ריבוז5. המגוון הכימי מעלה את האפשרות כי ברורים משעולים הביוכימי ייתכן סמכינן על תיקון סוגים שונים של קריאות Dpc. זה היה עם חשש זה בראש כי וזמינותו הצהבת-qPCR פותחה.
מספר טכניקות פותחו כדי לזכות בתובנה ביולוגיה מולקולרית של תיקון DPC הסלולר. הבאות מספק סקירה של הגישות הגדולות אשר פותחו, עם סיכום של הרב-סרן חולשות כל יש איכויות. ראוי לציין כי בעוד סיכום זה מתמקד מחקרים של תיקון DPC במערכות תרבות בתרבית של תאים, תרומות משמעותיות על הדגם הנוכחי של תיקון DPC נעשו באמצעות מערכות מיקרוביאלי ונטולת תא לא דנו בזה כתב היד.
אולי האסטרטגיה הקלה ביותר שניתן לנקוט כדי לזכות בתובנה הגנטיקה של תיקון DPC הוא להעריך את הרגישות בהתאמה למוות תא שנצפו בתאי פראי-סוג של מוטציה נחשפים סוכנים זירוז Dpc6,7. אסטרטגיה זו היא יחסית מהירה, זולה, לא דורשת מומחיות ייחודית מעבר היכולת לבצע טכניקות התרבות התא הבסיסי. לניסיוני יתרונות אלה הם מגבלות רבות לגישה זו כולל את הפעולות הבאות. ראשית, וזמינותו לא ישירות למדוד DNA לתקן. ההנחה שבבסיס אסטרטגיה זו היא כי inactivating מוטציות בגנים קידוד חלבונים תיקון ה-DNA הרלוונטיים תוצאות הצטברות של ה-DNA נזק זה מוות תאי מתוכנת גורמים מפעילים. עם זאת, מוטציות בגנים קידוד חלבונים שאינם-ה-DNA לתקן יכול, שבעיקרון לשפר (או לצמצם) רגישות הסלולר מוות תאי xenobiotic-induced. שנית, סוכנים יוצר Dpc תמיד לגרום סוגים אחרים של נזק לדנ א (יוצאת דופן היא 5-עזה-2′-deoxycytadine, אך סוכן זה גם מכלה methyltransferase הסלולר רמות8). כתוצאה מכך, זה מתקבל על הדעת כי רגישות יתר הסלולר משופרת לסוכן המדובר עשוי לשקף פגמים תיקון interstrand crosslinks או נגעים אחרים. שלישית, כאמור לעיל, קריאות Dpc מייצגים כיתה הטרוגנית מאוד מורכבת מסוגים שונים של crosslinks כימיים, מעורבים שותפים חלבונים שונים. זה אפשרי בזמן תיקון של אחד או יותר תת סוגים של נגעים אלה עשויים להשתנות ב רקע גנטי מסוים, ייתכן ההבדל הזה לא יספיק לשנות משמעותית את הסלולר רגישות יתר עד מוות הנגרם על ידי סוכן זה. לסיכום, בעוד אסטרטגיה זו מייצג נקודת אטרקטיבי, המפורטות לעיל להדגיש את החשיבות של מרדף אחר שיטות אחרות, ישירה יותר ללמוד את קינטיקה של DPC תיקון.
מספר גישות קשורים פותחו להשגת מטרה זו. למשל, חוקרים פיתחו שיטות כדי להבחין בין DNA ‘חינם’ ו- ‘חלבון מכורך’ DNA9,10,11. באמצעות הגישות האלה, זה אפשרי להשוות בין רמות מצב יציב של קריאות Dpc או עקב חשיפה סוכן מייצרי DPC ב מרקע גנטי. שתי אסטרטגיות נעשה בהם שימוש נרחב ביותר לערב הפרדת DNA המכיל DPC מ- DNA חינם באמצעות ניטרוצלולוזה ממברנה מחייב אסטרטגיה או אשלגן כלורי/מרחביות משקעים12,13. בגישה לשעבר תאים lysed, עברו דרך מסנן ניטרוצלולוזה. מכיוון ניטרוצלולוזה נקשר חלבון, המסנן שומר על DNA מקושרים-חלבון, המתיר DNA חופשי לעבור. באסטרטגיית האחרון חלבון מכורך DNA מופרד DNA חופשי מבוססת על העובדה מרחביות נקשר חלבון אבל לא ה-DNA, יכול להיות זירז ידי התוספת של אשלגן כלורי. כתוצאה מכך, DNA מקושרים-חלבון הופך לא מסיסים בעוד דנ א לא מאוגד נשאר בפתרון. DNA המכיל DPC יכול אז ניתן quantitated באמצעות תימידין radiolabeled (אם תאים הודבקו תוויות בתחילה סמויה) או על-ידי סלקטיבית הדי הפלורסנט כמו Hoechst 33258. שיטות אלה לשחזור, לדרוש מספר צעדים קטנים. עם זאת, הם אינם מספקים מידע לגבי האופי של crosslink כימי שדרכו חלבון מחובר ל- DNA. יתר על כן, חשוב לציין, אלה מבחני יתר עשויים להעריך DPC לתקן כשקלע שקרית תיקון לא שלם, קרי, הפרוטאוליטי עיבוד כדי crosslinks DNA-פפטיד קטן זה לא יכול להיות בקלות לכוד או זירז, כמו DNA בתום-לב תיקון.
מבחני שביט ניתן להמחיש DPC היווצרות תאים14. בניסויים אלה, הנוכחות של קריאות Dpc להקטין את ההעברה דנ א אשר יכול להיות הפוך על-ידי pretreating עם proteinase ק. לכן, אורך הזנב יכול לשמש כדי להעריך DPC היווצרות. עם זאת, כפי שהוזכר לעיל, סמים להיוות DPC ליצור סוגים אחרים של נזק לדנ א אשר יכול לשנות את אורך הזנב. פרוטוקול זה גם מיומנויות טכניות גבוהות, דורש התמחות והכשרה בתחום ההדמיה קונפוקלי.
ספקטרומטר מסה ניתן ללמוד DPC תיקון קינטיקה לאחר הטיפול עם crosslinking סוכנים15,16,17. ניסויים אלה יטפל בתאים עם סוכנים להיוות DPC ולבודד Dpc ויה ביוטין לכידה או פנול: כלורופורם החילוץ (1:1). ספקטרומטר מסה יכול לשמש לאחר מכן כדי לזהות את החלבונים תפור או quantitate את כמות קריאות Dpc נוצר לאורך זמן. היתרון העיקרי של גישה זו היא מהות הנתונים הופק. זה אפשרי בדיוק קטלוג סוגי חלבונים להיות תפור בעקבות חשיפה xenobiotic, עם זאת, פרוטוקול זה יקר, זמן רב, והוא מוגבל לפי סוג crosslink שניתן לאתר.
. מייזלס ואח פיתח רגישות ‘מכ ם’ (גישה מהירה ל- DNA adduct השחזור) הנועד quantitate immunodetection של חלבון-דנ א adducts כמו גם מכ ם מבוסס על אליסה assay18,19. אלה מבחני שימושיות במיוחד עבור השמנה intermediates חלבון-דנ א זה transiently טופס בתאים ולהפיק דוגמיות מתאים לספקטרומטרית לזיהוי חלבון חדש adducts. Assay immunodetection הזה מסתמך על הזמינות של נוגדנים כדי ללכוד את crosslink חלבון-דנ א ו, לכן, עשויים להיות מסוגלים זיהוי ה-DNA מפורק-פפטיד adducts טופס זה במהלך תיקון. לאחרונה, מסוים DPC תיקון מסלול מקושר שכפול ה-DNA, על metalloprotease תלויי-DNA הספרטני התגלה ב Dpc אשר הם proteolyzed כדי פפטידים קטנים במהלך תיקון20,21. בירושה מוטציות בגן הזה קשורים עם תסמונת Ruijs-Aalfs בבני אדם, מחלה המאופיינת על ידי אי יציבות גנומית, הזדקנות מוקדמת, סרטן הכבד22. עכברים עם פגמים הגן ספרטני מהונדס גנטית להציג פנוטיפים דומה23.
התא המארח שהפעלה של פעילות גנים ברמת השעתוק שימש ללמוד התיקון הנוכחי על פלסמיד transfected DNA סובסטרטים24,25מוגדר נגעים. בניסויים אלה, פלסמיד המכיל קריאות Dpc (או סוגים אחרים של נגעים DNA) זה לחסום שעתוק של עיתונאי, כגון לוציפראז, הן transfected לתוך התאים. הפריה חוץ גופית מדידות לקח 24-72 שעות מאוחר יותר הם מכן בקורלציה עם DPC תיקון. אולם, מבחני תיקון עקיף אלה אינם מסוגלים גילוי תיקון אירועים מוקדם יותר תקנים לאחר 24 שעות, לא יכולים להבדיל בין RNA פולימראז מעקף של סובסטרטים תוקן חלקית ותיקון מלא.
כל אחת מהשיטות שתוארו לעיל יש יתרונות, תרמה המודל הנוכחי של DPC תיקון. עם זאת, וזמינותו הצהבת-qPCR עוקף כמה מן המגבלות הקשורות אלה גישות אחרות, וכתוצאה מכך יכול לספק יותר ספציפי תובנה DPC תיקון מנגנונים. לדוגמה, וזמינותו הצהבת-qPCR יכול למדוד ישירות תיקון ה-Dpc בייעודי לאתר על ה-DNA בתאים בתרבית של שלם. בשיטה זו הוא תכליתי, נעשה כדי להשיג תוצאות תיקון בעקבות תרביות תאים האוגרים ואת שורות תאים אנושיים. תרביות תאים של פלסמיד יכולה להתבצע באמצעות lipofection או אלקטרופורציה בקווים בתרבית של תאים בתרבית. זה גם מבטיח כי רק תיקון ה-Dpc מוגדר נמדד, לא סוגים אחרים של נזק לדנ א המושרה על ידי סוכנים להיוות DPC רוב. הצהבת-qPCR הוא קל לביצוע, זולה, מהירה. התוצאות המתקבלות באמצעות assay הזה גילו תיקון אירועים מוקדם ככל תקנים שלאחר 2 h. באמצעות שיטה זו, משתני שעשוי להשפיע על תוצאות התיקון DPC ניתן יהיה ללמוד באופן רגיש ויעיל. לדוגמה, התפקיד של שעתוק DPC תיקון טרם ניתן להעריך בקפדנות. בשל הגמישות של וזמינותו הצהבת-qPCR, אתר crosslinking DPC ניתן לטפל כדי להתייחס לשאלה זו. בנוסף, מבוא מוצא של שכפול לתוך פלסמיד DPC מניבי ניתן לפנות את ההשפעה של שכפול-DPC תיקון. בנוסף, crosslinks מרובים יכולים להיווצר על פלסמיד לבחון הבדלים תיקון DPC יחיד לעומת crosslinks מרובים. . אלו שאלות יהיה קשה לענות עליהן באמצעות בהכפלת ה-DNA, אבל בקלות ניתן לטפל באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR הכללית, וזמינותו הצהבת-qPCR דורש מטוהרים, דנ א פלסמיד בכמויות מיקרוגרם המכיל פצע של מיקום מוכר. Adducts חוץ assay זו יכולה לשמש DPC, עם זאת, הנגע חייב להיות מסוגל חסימת הרחבה על ידי אנזימים.
השיטה הצהבת-qPCR מציע יתרונות רבים על פני גישות אחרות על-ידי בדיקת התיקון של אוכלוסיה הומוגנית המכיל פצע DPC יחיד, הגדרה. ראוי לציין בנוסף לשליטה זהותו של החלבון ואת הסוג של crosslink כימיים המשמשים להתחברות החלבון ה-DNA, שזה אפשרי לתמרן בקלות את ההקשר רצף שאליו הנגע DPC הוא הציג. בחנו את ההשפעה על תיקון DPC של היכרות עם הנגע בשני התבנית או קידוד לשריד פלסמיד במורד הזרם של לוקוס promotor פעיל. באופן דומה, אנחנו בתהליך של חוקרים את ההשפעה על תיקון DPC של שכפול באמצעות פלסמיד M13 המכיל בדר SV40 של שכפול transfected לתאים HEK293T. וזמינותו המתוארים בזאת ישירות DPC אמצעי תיקון, לעומת שיטות אחרות כגון הפעלה מחדש התא המארח בעקיפין הערכות לתקן פעילות24,25. בנוסף, המערכת היא חזקה, רגיש, כמותית. בניגוד למערכות אחרות, אשר מודדת להסרת DPC, וזמינותו הזה רק מזהה אירועי תיקון מלא, קרי, זה דורש לא רק כי הנגע DPC להסירו אלא כי התקינות של ה-DNA דופלקס להיות מלא שוחזר17. זה בגלל abasic אתרים ו ניקס או מעברי ב עמוד השדרה phosphodiester לחסום וזמינותו בצורה יעילה כמו המקורי DPC הנגע29.
בעוד דוח זה מתמקד מסוג מסוים DPC, אשר נוצר על ידי השמנה borohydride של תגובה אנזימטית ביניים, אנו כעת מפתחים גישות ללמוד תיקון ה-Dpc מעורבים אחרים חלבונים נגעים שבו הצמדה חלבון ה-DNA מתרחשת דרך הבסיס nucleoside, יותר מאשר המיקום ריבוז. שימוש amination חותכות, יצרנו crosslinks חלבון ופפטיד מצורף גואנין או ציטוזין הבסיס של פריימר הדנ א30. Oligonucleotides אלה היו לטהר את ההומוגניות, המשמש ליצירת פלסמידים supercoiled המכיל חלבון-דנ א של ה-DNA-פפטיד crosslinks. בעוד היעילות של תגובות אלו מעט מופחת ביחס לזה של הגישה crosslink glycosylase oxoguanine תיאר בפירוט לעיל, הם אף על פי כן הוכתרו בהצלחה, לאפשר הבחינה של התיקון של סובסטרטים אלה בפראי-סוג וקווים נוקלאוטיד כריתה חשוכת-תיקון בתרבית של תאים. השתמשנו גם וזמינותו הצהבת-qPCR ללמוד התיקון של נגעים oxoguanine ואת המספר של כולסטרול ריבוז סינתטי המשלים, אשר הוצג בעבר לתיקון באמצעות מכונות31תיקון כריתה נוקלאוטיד הסלולר. כמו באיור 2 מתארת בצורה גרפית, תיקון של כל הנגע כי הארכת תחל בלוקים על ידי אנזימים, באופן עקרוני, ניתן למדוד באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR.
המודלים הנוכחיים של תיקון DPC מראים כי קריאות Dpc גדול (> 10 kDa) ותוחלת הפרוטאוליטי עיבוד כדי הנגע פפטיד קטן לפני הסרת32,33,34. אחראי על proteolysis הזה ככל הנראה מועמדים את פרוטאוזום או פרוטאז ספציפיים בתאי אדם בשם ספרטה20,21,35,36,37, 38. חקירות נוסף התפקידים של פרוטאזות אלו יכול להתבצע באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR. מעכבי פרוטאוזום יכול לשמש pretreat תאים לפני תרביות תאים עם המכילות DPC סובסטרטים. לחלופין, שורות תאים תמונות ציפורים ספרטני יכול להיות transfected עם פלסמידים פגום התירי את תפקידה proteolysis קריאות ה-Dpc גדול יותר.
ללא קשר השיטה שבה נעשה שימוש כדי ליצור את crosslink או את טיב הנגע דנ א, זה שווה והדגיש כי המתודולוגיה הצהבת-qPCR תלויה באופן ביקורתי היכולת להפיק כמויות ניכרות של המצע DPC-פלסמיד הומוגנית. צעדים חיוניים עבור ניתוח זה כוללים טיהור של covalently, פלסמיד עגול סגור בעקבות הארכת תחל כדי לחסל את כל גנב או מולקולות פלסמיד ליניארי. חייב להיות מחוסל מזהמים אלה כדי להבטיח כי כל תיקון DPC שלאחר מכן נצפתה ואינו מכוון לשבור תיקון מכוון ניק או כפול-strand תהליכים. כשל להצטייד בכמות מספקת של supercoiled ה-DNA בעקבות תגובות סיומת פריימר יכול להתגבר על ידי משתנה היחס בין oligonucleotide ל- DNA חד-גדילי. צעד חשוב נוסף עבור שיטת הצהבת-qPCR, הוא יעילות crosslinking החלבון פלסמיד. במחקר זה, שימש תגובה בלתי יעילה, אנזימטי כדי crosslink החלבון glycosylase oxoguanine כדי הנגע 8-אוקסו-גואנין. Crosslinking משנה אופטימלית יכולים להשתפר על ידי שינוי כמות חלבון להוסיף את התגובה.
בעוד הממצאים המתוארים בדו ח זה הסתמך על lipofection להציג DPC תיקון סובסטרטים לתוך תאים הנמען, אין שום סיבה, א-פריורי, לא יכול להיות מועסק בשיטות אחרות transfections. יש לבצע מחקרים ראשוניים ואנו ציין שכי אלקטרופורציה39 יכול לשמש גם. עם זאת, ראוי לציין כי מניסיוננו אלקטרופורציה תרביות תאים יעילות מופחתת בהשוואה ל- lipofection, זה הכרחי להשתמש DNA המוביל (עד 5 µg) בנוסף µg 1.5 של מצע DPC כדי לקבל תיקון נתונים. בסך הכל, השיטה הצהבת-qPCR המתוארת לעיל מספק דרך חדשנית כדי לבחון DPC תיקון על פלסמיד ה-DNA ולהפיק תובנה חדשה התגובה נזק DNA באופן בלעדי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (ES023350). ליסה צ’סנר נתמך על ידי מענק הדרכה 5T32HL007741. אנו מודים נטליה Tretyakova (אונ’ מינסוטה) Ashis Basu (אוניברסיטת קונטיקט) ואת חבריהן מעבדה עבור תמיכה עצות טכניות במהלך המוקדמות ואת שלבי ביניים של עבודה זו.
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |