Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale
Summary
Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.
Abstract
Ghiandola salivare sottomandibolare (SMG) è uno dei tre ghiandole salivari maggiori ed è di interesse per molti diversi campi della ricerca biologica, tra cui immunologia, oncologia, odontoiatria e biologia cellulare. La SMG è una ghiandola esocrina composto da cellule epiteliali secretive, miofibroblasti, cellule endoteliali, nervi e matrice extracellulare. Processi dinamici cellulari nel ratto e topo SMG precedentemente sono stato ripreso, principalmente utilizzando invertito sistemi multi-fotone microscopio. Qui, descriviamo un semplice protocollo per la preparazione chirurgica e la stabilizzazione di SMG murino in topi anestetizzati per in vivo imaging con sistemi di microscopio verticale multi-fotone. Presentiamo insiemi di immagine videomicroscopia rappresentativa di endogeno e trasferiti passivamente cellule fluorescenti, tra cui l’etichettatura dei vasi sanguigni o condotti salivari e generazione di seconda armonica di visualizzare collagene fibrillare. In somma, il nostro protocollo consente preparazione chirurgica delle ghiandole salivari del mouse nei sistemi di microscopia in posizione verticale, che sono comunemente usati per l’imaging intravital nel campo dell’immunologia.
Introduction
Saliva è secreta dalle ghiandole esocrine per lubrificare il cibo, proteggere le superfici mucose del tratto orale e per fornire gli enzimi digestivi, nonché sostanze antimicrobiche1,2. Oltre alle ghiandole salivari minori sparpagliate nel submucosa orale, ci sono tre insiemi bilaterale delle ghiandole importanti identificate come parotidea, sublingual e sottomandibolare, in base alla loro posizione1,2. Cellule epiteliali a forma di piramide, organizzati in boccetta-a forma di sacs (acini) o demilunes che sono circondati dalle cellule myoepithelial e una membrana dello scantinato, secernono i componenti sierose e mucose di saliva1. Il luminal spazio stretto degli scarichi dei acini nei dotti intercalate, che uniscono nei condotti striati, fino a quando finalmente si uniscono in un unico dotto escretore1. Il dotto escretore principale della SMG è chiamato dotto di Wharton (WD) e si apre nella caruncola sublingual3,4. Il vano epiteliale SMG rappresenta pertanto una struttura altamente arborized con collettore terminale endpoint, simile ad un fascio di uva1,5,6. L’interstizio SMG è composto da vasi sanguigni e linfatici, incorporati nel tessuto connettivo7 contenente nervi parasimpatici8 e matrice extracellulare5. Ghiandole salivari normali umani e roditori contengono anche cellule T, macrofagi e cellule dendritiche9, così come le cellule di plasma che secernono immunoglobuline A (IgA) in saliva9,10. Grazie alle sue molteplici funzioni nella salute e nella malattia, il SMG è un argomento di interesse per molti campi della ricerca biologica, tra cui odontoiatria4, immunologia11, oncologia12,8di fisiologia e biologia cellulare 3.
Imaging dei processi cellulari dinamici e interazioni è un potente strumento nella ricerca biologica13,14. Lo sviluppo del tessuto profondo imaging e innovazioni inmicroscopes basato su ottica non lineare (NLO), che si basano su scattering o assorbimento di fotoni più dal campione, ha permesso di esaminare direttamente i processi cellulari in tessuti complessi13 ,15. Assorbimento di fotoni più implica la distribuzione dell’energia di eccitazione totale dai fotoni di bassa energia, quali eccitazione fluoroforo confini per il piano focale e permette così la più profonda penetrazione del tessuto con ridotta photodamage e rumore da fuori fuoco eccitazione13,15. Questo principio è impiegato da microscopia del due-fotone (14) e consente per l’imaging di fluorescenza esemplari nelle profondità di fino a 1 mm15,16. Mentre commercialmente disponibili 14 configurazioni sono diventati facile da usare e affidabile, la grande sfida per l’imaging di videomicroscopia è attentamente esporre e stabilizzare l’organo bersaglio dei topi anestetizzati, soprattutto per l’imaging delle serie di lasso di tempo. Diversi metodi per la correzione digitale deriva dopo acquisizione dati sono stati pubblicati17,18 e recentemente abbiamo sviluppato “VivoFollow”, un sistema di correzione automatica, che contrasta il tessuto lento deriva in tempo reale utilizzando un computerizzato fase19. Tuttavia, è ancora fondamentale per alta qualità delle immagini per ridurre al minimo movimento del tessuto, particolarmente veloci movimenti provocati dal respiro o battito cardiaco19. Procedure di preparazione e di stabilizzazione sono state pubblicate per gli organi multipli, compreso il midollo spinale20, fegato21, pelle22, polmone23e linfonodo24. Inoltre, modelli per l’imaging della ghiandola salivaria del ratto sono stati sviluppati3,25 e ulteriormente raffinato per l’imaging videomicroscopia ad alta risoluzione di murino che SMG su misura per un microscopio invertito installazione26, 27 , 28.
Qui, presentiamo un protocollo pratico ed adattabile per videomicroscopia imaging di SMG murino usando la microscopia non lineare verticale, che è comunemente usata per l’imaging intravital nel campo dell’immunologia. A tal fine, abbiamo modificato una fase di immobilizzazione ampiamente autonomo utilizzata per preparazioni popliteal di linfonodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo offre un approccio diretto per l’imaging in vivo di murine ghiandole salivarie sottomandibolari e sublinguale usando la microscopia non lineare verticale spesso utilizzata nel campo dell’immunologia. Il metodo può essere adattato per l’imaging di altre ghiandole esocrine della regione del collo e della testa. Per esempio, il nostro laboratorio ha eseguito imaging della ghiandola lacrimale in modo analogo (non mostrato).
Rimuovendo il tessuto connettivo intorno la SM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale svizzero (SNF) progetto grant 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (a JVS) e Leopoldina nell’Unione fraterna LPDS 2011-16 (BS). Questo lavoro ha avvantaggiato da configurazioni ottiche del “Microscopia Imaging Center” (MIC) dell’Università di Berna.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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