הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול בניתוח לחשוף ולייצב את בלוטת הרוק submandibular מאתר עבור הדמיה intravital באמצעות מיקרוסקופ intravital זקוף. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות אחרים בלוטות אקסוקרינית של הראש, באזור הצוואר של עכברים ומכרסמים קטנים אחרים.
Abstract
בלוטת הרוק submandibular (SMG) הוא אחד של בלוטות הרוק הגדולות שלוש, הוא עניין בתחומים רבים ומגוונים של המחקר הביולוגי, כולל ביולוגיה של התא, אונקולוגיה, רפואת שיניים, אימונולוגיה. SMG היא בלוטה אקסוקרינית מורכב של תאים אפיתל הפרשה, myofibroblasts, תאי אנדותל, עצבים, מטריצה חוץ-תאית. בעבר יש כבר תמונה דינמית תהליכים תאיים החולדה, העכבר SMG, בעיקר באמצעות הפוכה מיקרוסקופים פוטונים ריבוי מערכות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור הכנה כירורגית ו ייצוב SMG מאתר בעכברים ומורדמת עבור ויוו הדמיה עם מערכות מיקרוסקופים פוטונים מרובה זקוף. אנו מציגים תמונה intravital נציג סטים של אנדוגני, הועבר adoptively פלואורסצנט תאים, כולל תיוג של כלי הדם או צינוריות הרוק ואת הדור השני הרמונית להמחיש קולגן fibrillar. לסיכום, פרוטוקול שלנו מאפשר הכנה כירורגי של בלוטות הרוק העכבר במערכות מיקרוסקופ זקוף, אשר משמשים בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה.
Introduction
הרוק הוא מופרש על ידי בלוטות אקסוקרינית לשמן מזון, להגן על משטחים הרירית של מערכת אוראלי, וכדי לספק אנזימי העיכול, כמו גם חומרים מיקרוביאלית1,2. בנוסף בלוטות הרוק קטין וביניהם ב submucosa דרך הפה, ישנם שלוש קבוצות דו צדדיים של בלוטות הגדולות מזוהות הפרוטיד, sublingual, submandibular, לפי המיקום שלהם,1,2. תאים אפיתל בצורת פירמידה, המסודרות בצורת הבקבוק שקי (acini) או demilunes זה מוקף קרום המרתף, והתאים myoepithelial מפרישים הצפק, ריריות מרכיבי הרוק1. ברווח luminal הצר acini מתנקז לתוך צינוריות intercalated, אשר התאחדו לתוך צינוריות תילומית עד שהם סוף סוף להצטרף לתוך צינור excretory1. ההדבקה excretory הראשי של SMG נקרא צינור וורטון (WD) ופותח לתוך3,sublingual caruncle4. תא אפיתל SMG מייצג ולכן מבנה מאוד arborized עם הקצה מסוף סעפת, הדומה צרור של ענבים-1,–5,–6. Interstitium SMG מורכב של כלי הדם, הלימפה בתוך רקמת חיבור7 המכיל העצבים הפאראסימפתטית8 ו מטריצה חוץ-תאית5. בלוטות הרוק רגיל של האדם ושל מכרסמים מכילות גם T תאים מקרופאגים, תאים דנדריטים9, כמו גם תאים פלזמה להפריש אימונוגלובולינים (איגה) לתוך רוק9,10. בשל תפקידיה הגיוון הרב של מחלה ובריאות, SMG הוא נושא מעניין עבור שדות רבים של המחקר הביולוגי, כולל רפואת שיניים4, אימונולוגיה11, אונקולוגיה12, פיזיולוגיה8וביולוגיה של התא 3.
הדמיה של תהליכים תאיים דינאמית ואינטראקציה הוא כלי רב עוצמה המחקר הביולוגי13,14. הפיתוח של רקמות עמוק הדמיה וחידושים inmicroscopes מבוסס על אופטיקה לא לינארית (NLO), אשר מסתמך על פיזור או קליטת פוטונים מרובים על-ידי המדגם, אפשרה לבדוק ישירות תהליכים תאיים ברקמות מורכבות13 ,15. קליטת פוטונים מרובים כרוכה משלוח של עירור סה כ האנרגיה על ידי אנרגיה נמוכה פוטונים, איזה עירור fluorophore וביתנו למישור מוקד, ובכך מאפשר חדירה רקמות עמוק ועם צמצום נזקי רעש מחוץ המוקד עירור13,15. עיקרון זה הוא מועסק על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים (מהשעה 2) ומאפשר הדמיה של דגימות פלורסנט בעומקים של עד 1 מ מ15,16. תוך זמינים מסחרית-2 בצהריים setups הפכו להיות ידידותי, אמין, האתגר העיקרי עבור הדמיה intravital היא בקפידה לחשוף ולייצב את איבר היעד ומורדמת עכברים, במיוחד עבור הדמיה של זמן לשגות סדרות. מספר שיטות לתיקון דיגיטלי הסחף לאחר קירור והקפאה כבר פורסם17,18 , לאחרונה פיתחנו “VivoFollow”, מערכת תיקון אוטומטי, אשר מנטרל את רקמת איטי להיסחף בזמן אמת באמצעות הבמה הממוחשבת19. עם זאת, עדיין במצב קריטי לאיכות גבוהה הדמיה כדי למזער את רקמת תנועה, במיוחד מהר תנועות הנגרמת על ידי נשימה או פעימת לב19. הליכי הכנה וייצוב פורסמו עבור איברים מרובות, כולל חוט השדרה20, הכבד21, העור22, ריאות23, ו הלימפה24. יתר על כן, מודלים עבור עכברים בלוטת הרוק הדמיה יש כבר פיתח3,25 ומעודן יותר עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה intravital של מאתר ש-SMG למידותיו מיקרוסקופ הפוכה ההתקנה26, 27 , 28.
כאן, אנו מציגים מעשי וישימה עבור הדמיה intravital של SMG מאתר פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ לא לינארית זקוף, המשמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה. לשם כך, שינינו שלב הנייח מועסקים נרחב המשמש ההכנות popliteal הלימפה בבית השחי הצומת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציעה גישה ישירה עבור ויוו הדמיה של מאתר בלוטות הרוק submandibular, sublingual באמצעות מיקרוסקופ ליניארי זקוף משמש לעתים קרובות בתחום אימונולוגיה. השיטה ניתן להתאים עבור ההדמיה בלוטות אקסוקרינית אחרות באזור הראש והצוואר. למשל, המעבדה שלנו ביצע הדמיה של בלוטת הדמעות באופן מקביל (לא מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי הקרן הלאומית השוויצרית (SNF) פרויקט גרנט 31003A_135649, 31003A_153457, 31003A_172994 (ל JVS), מלגת Leopoldina LPDS 2011-16 (כדי BS). עבודה זו כמיותרים setups אופטי של “מיקרוסקופ הדמיה מרכז” (MIC) באוניברסיטת ברן.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
