Voorbereiding van lymfkliertest submandibulaire speekselklier rechtop Intravital microscopie
Summary
We beschrijven een protocol om operatief bloot en stabiliseren de lymfkliertest submandibulaire speekselklier voor intravital geschikt zijn met behulp van rechtop intravital microscopie. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere exocrine klieren van het hoofd en nek regio van muizen en andere kleine knaagdieren.
Abstract
De submandibulaire speekselklier (SMG) is één van de drie grote speekselklieren en is van belang voor veel verschillende velden van het biologisch onderzoek, met inbegrip van celbiologie, oncologie, tandheelkunde en immunologie. De SMG is een exocrine klier bestaat uit secretoire epitheliale cellen, myofibroblasts, endotheliale cellen, zenuwen en extracellulaire matrix. Dynamische cellulaire processen in de rat en muis SMG hebben eerder al beeld, meestal met behulp van omgekeerde multi foton microscoop systemen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de chirurgische voorbereiding en stabilisatie van de lymfkliertest SMG in narcose muizen voor in vivo imaging met rechtop multi foton microscoop systemen. Wij presenteren representatieve intravital afbeelding sets van endogene en adoptively overgedragen fluorescerende cellen, met inbegrip van de etikettering van bloedvaten of speeksel buizen en tweede-harmonische generatie aan het visualiseren van fibrillar collageen. Kortom voorziet ons protocol chirurgische voorbereiding van muis speekselklieren in rechtop microscopie systemen, die vaak worden gebruikt voor intravital beeldvorming op het gebied van de immunologie.
Introduction
Speeksel is afgescheiden door klieren exocrine voedsel smeren, beschermen de mucosal oppervlakken van de mondelinge tractus en leveren van spijsverteringsenzymen evenals antimicrobiële stoffen1,2. Naast kleine speekselklieren afgewisseld in de mondelinge submucosa, zijn er drie bilaterale sets van grote klieren parotide, sublinguaal en submandibulaire, genoemd volgens hun locatie1,2. Piramide-vormige epitheliale cellen, georganiseerd in de kolf-vormige zakjes (acini) of demilunes die zijn omgeven door myoepithelial cellen en het membraan van een kelder, de sereuze en slijm componenten van speeksel1afscheiden. De smalle luminal ruimte van de acini-riolering in tussenliggende leidingen, die in gegroefde leidingen verenigen totdat ze tenslotte tot een enkele uitscheidingsmechanisme koker1 voegen. De belangrijkste uitscheidingsmechanisme buis van het SMG heet Wharton de koker (WD) en wordt geopend in de sublinguale caruncle3,4. De SMG epitheliale compartiment vertegenwoordigt daarom een zeer arborized structuur met spruitstuk terminal eindpunten, die lijkt op een bundel van druiven1,5,6. De SMG interstitium bestaat uit bloed- en lymfestelsel schepen ingesloten in bindweefsel7 met parasympathische zenuwen8 en5van de extracellulaire matrix. Normale menselijke en knaagdier speekselklieren bevatten ook T cellen, macrofagen en dendritische cellen9, evenals plasmacellen die afscheiden van immunoglobuline een (IgA) in het speeksel9,10. Als gevolg van haar veelzijdige functies bij gezondheid en ziekte is de SMG een onderwerp van belang voor veel toepassingsgebieden biologisch onderzoek, met inbegrip van de tandheelkunde4, immunologie11oncologie12, fysiologie8en celbiologie 3.
Beeldvorming van dynamische cellulaire processen en interacties is een krachtig hulpmiddel in biologisch onderzoek13,14. De ontwikkeling van diepe weefsel beeldvorming en innovaties inmicroscopes op basis van niet-lineaire optica (NLO), die vertrouwen op verstrooiing of absorptie van meerdere fotonen door het monster, mag heeft direct onderzoek cellulaire processen in complexe weefsels13 ,15. Absorptie van meerdere fotonen omvat de levering van de totale excitatie-energie door lage-energie fotonen, welke excitatie van de fluorophore grenzen aan het brandvlak en dus kunt dieper weefsel penetratie met verminderde photodamage en lawaai buiten de focus excitatie13,15. Dit beginsel is werkzaam bij twee-foton microscopie (2 PM) en zorgt voor de beeldvorming van fluorescerende modellen in de diepten van maximaal 1 mm15,16. Terwijl verkrijgbare 2 PM opstellingen zijn geworden, gebruiksvriendelijk en betrouwbaar, is de grote uitdaging voor intravital imaging zorgvuldig bloot en stabiliseren van het orgaan van de doelstelling van narcose muizen, vooral voor de beeldvorming van tijdreeksen komen te vervallen. Verschillende methoden voor digitale drift correctie na data-acquisitie hebben gepubliceerd17,18 en wij onlangs ontwikkelde “VivoFollow”, een systeem van geautomatiseerde correctie, dat zacht weefsel drift in real-time met behulp van tegengaat een geautomatiseerde etappe19. Het is echter nog steeds van cruciaal belang voor hoge kwaliteit imaging om te minimaliseren van weefsel beweging, vooral snelle bewegingen veroorzaakt door ademhaling of hartslag19. Voorbereiding en stabilisatie procedures zijn gepubliceerd voor meerdere organen, met inbegrip van ruggenmerg20, lever21huid22, Long23en lymfeklier24. Bovendien, modellen voor rat speekselklier imaging zijn ontwikkelde3,25 en verder verfijnd voor hoge resolutie intravital beeldvorming van de RattenUitrustingen die SMG afgestemd op een omgekeerde Microscoop setup26, 27 , 28.
Hier presenteren we een praktische en flexibele protocol voor intravital beeldvorming van de lymfkliertest SMG met behulp van rechtop niet-lineaire microscopie, die meestal voor intravital beeldvorming op het gebied van de immunologie gebruikt wordt. Te dien einde bewerkt we een grote schaal werknemers immobilisatie stadium gebruikt voor popliteale lymfeklier preparaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een eenvoudige benadering voor in vivo imaging van lymfkliertest submandibulaire en sublinguale speekselklieren met behulp van rechtop niet-lineaire microscopie vaak gebruikt op het gebied van de immunologie. De methode kan worden aangepast voor de beeldvorming van andere exocrine klieren in het hoofd en de nek regio. Bijvoorbeeld, heeft ons lab beeldvorming van de traanklier uitgevoerd op een soortgelijke wijze (niet afgebeeld).
Het verwijderen van het bindweefsel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) project subsidie 31003A_135649, 31003A_153457 en 31003A_172994 (voor JVS) en Leopoldina fellowship LPDS 2011-16 (aan BS). Dit werk profiteerden van optische opstellingen van het “microscopie Imaging Center” (MIC) van de Universiteit van Bern.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
