Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

Speichel abgesondert durch therapeutisches Drüsen zu essen zu schmieren, schützen die Schleimhaut-Oberflächen des oralen Traktes und liefern Verdauungsenzyme sowie antimikrobielle Substanzen^1,2. Neben kleinen Speicheldrüsen in der mündlichen Submukosa durchsetzt gibt es drei bilaterale Sätze von großen Drüsen als Parotis, sublinguale und submandibulären, entsprechend ihrer Lage^1,2. Pyramidenförmige Epithelzellen in Kolben-förmigen Säcke (Azini) organisiert oder Lünetten, die myoepithelialen Zellen und einer Basalmembran umgeben sezernieren die serösen und Schleimhaut Komponenten der Speichel¹. Die engen luminalen Raum der Azini Gullys in eingefügten Leitungen, die in gekerbten Leitungen zu verbinden, bis sie schließlich in einem einzigen ausführungsgang¹teilnehmen. Die wichtigsten ausführungsgang von der SMG heißt Wharton Rohr (WD) und mündet in die sublingual Karunkel^3,4. Das SMG epitheliale Fach stellt daher eine stark verzweigten Struktur mit vielfältigen terminal Endpunkte, ähnlich wie ein Bündel Trauben^1,5,6. Die SMG Interstitium besteht aus Blut und lymphatische Behälter eingebettet in Bindegewebe⁷ , die parasympathischen Nerven⁸ und extrazelluläre Matrix⁵enthalten. Normale menschliche und Nagetier Speicheldrüsen enthalten auch T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen⁹, sowie Plasmazellen, die Immunglobulin absondern (IgA) in den Speichel^9,10. Die SMG ist aufgrund seiner vielfältigen Funktionen in Gesundheit und Krankheit ein Thema von Interesse für viele Bereiche der biologischen Forschung, einschließlich Zahnmedizin⁴, Immunologie¹¹, Onkologie¹², Physiologie⁸und Zellbiologie ³.

Bildgebung der dynamische zelluläre Prozesse und Wechselwirkungen ist ein mächtiges Werkzeug in der biologischen Forschung^13,14. Die Entwicklung der Tiefenmassage Bildgebung und Innovationen Inmicroscopes basierend auf nichtlineare Optik (NLO), die Streuung und Absorption von mehreren Photonen durch die Probe verlassen, darf direkt zelluläre Prozessen in komplexen Gewebe^{13 untersuchen ,15}. Absorption von mehreren Photonen umfasst die Lieferung von insgesamt Anregungsenergie von niederenergetischen Photonen, welche Grenzen Fluorophor Erregung auf der Brennebene und somit tieferes Gewebe eindringen mit reduzierten lichtbedingten und Lärm von außerhalb der Fokus Erregung^13,15. Dieses Prinzip wird durch die zwei-Photonen-Mikroskopie (14:00) eingesetzt und ermöglicht die Abbildung von fluoreszierenden Proben in Tiefen von bis zu 1 mm^15,16. Während handelsübliche 14:00, die Setups benutzerfreundlich und zuverlässig geworden sind, ist die größte Herausforderung für die intravitalen Bildgebung sorgfältig setzen und stabilisieren das Zielorgan der narkotisierten Mäuse, vor allem für die Darstellung von Time-Lapse-Serie. Mehrere Methoden für digitale Drift-Korrektur nach der Datenerfassung wurden veröffentlicht^17,18 und wir vor kurzem entwickelt “VivoFollow”, eine automatische Korrektur-System, die langsame Gewebe Drift in Echtzeit mit entgegenwirkt ein computerisierte Stufe¹⁹. Es ist jedoch nach wie vor kritisch für hochwertige Bildgebung zur Minimierung von Gewebe Bewegung, vor allem schnelle Bewegungen, die durch Atmung oder Herzschlag¹⁹. Vorbereitung und Stabilisierung Verfahren wurden für mehrere Organe, einschließlich Rückenmark²⁰, Leber²¹Haut²², Lungen-²³und Lymphknoten²⁴veröffentlicht. Darüber hinaus Modelle für die Ratte Speicheldrüse Bildgebung weiter verfeinert für hochauflösende intravitalen Bildgebung der Murine SMG auf einem inversen Mikroskop Setup^26, zugeschnitten und wurden entwickelten^{3,25 27 , 28}.

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische und anpassungsfähige Protokoll für intravitalen Bildgebung der murinen SMG mit aufrechten nichtlineare Mikroskopie, die häufig zur intravitalen Bildgebung auf dem Gebiet der Immunologie dient. Zu diesem Zweck haben wir eine weithin eingesetzten Immobilisierung Bühne für popliteal Lymphknoten Vorbereitungen verwendet geändert.