Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale
Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour chirurgicalement exposer et stabiliser les glandes salivaires sous-maxillaires murine intravitale imagerie microscopie intravitale verticale. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres glandes exocrines de la tête et la région du cou de la souris et autres petits rongeurs.
Abstract
La glande salivaires sous-maxillaire (SMG) est l’une des trois principales glandes salivaires et présente un intérêt pour nombreux domaines de la recherche biologique, immunologie, oncologie, médecine dentaire et la biologie cellulaire. Le SMG est une glande exocrine, constituée de cellules épithéliales sécrétrices, myofibroblastes, cellules endothéliales, nerfs et la matrice extracellulaire. Des processus dynamiques cellulaires chez le rat et la souris SMG ont précédemment été imagés, utilisant surtout inversé systèmes de microscopie multiphotonique. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation chirurgicale et la stabilisation de la SMG murin souris anesthésiés pour l’imagerie in vivo avec des systèmes de microscope multiphotonique vertical. Nous présentons ensembles image intravitale représentative d’endogène et transféré Moutschen cellules fluorescentes, y compris l’étiquetage des vaisseaux sanguins ou des conduits salivaires et génération de seconde harmonique de visualiser de collagène fibrillaire. En somme, notre protocole permet une préparation chirurgicale des glandes salivaires de la souris dans les systèmes de microscopie verticale, qui sont couramment utilisés pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie.
Introduction
Salive est sécrétée par les glandes exocrines pour lubrifier les aliments, protéger les muqueuses des voies orale et pour fournir des enzymes digestives ainsi que des substances antimicrobiennes1,2. En plus des glandes salivaires intercalés dans la sous-muqueuse buccale, il y a trois ensembles bilatérales des glandes principales identifiées comme parotide, sublingual et sous-maxillaires, selon leur emplacement1,2. Cellules épithéliales en forme de pyramide, organisés dans des sacs en forme de fiole (acini) ou demilunes qui sont entourées de cellules myoépithéliales et une membrane basale, sécrètent les composants séreuses et muqueuses de salive1. L’espace étroit luminale des acini se déverse dans des conduits intercalés, qui s’unissent dans des conduits striés jusqu’à ce qu’ils rejoignent finalement dans un seul conduit excréteur1. Le conduit excréteur principal de la SMG est appelé canal de Wharton (WD) et s’ouvre sur la caroncule sublinguale3,4. Le compartiment épithélial SMG représente donc une structure très arborisée avec des points de terminaison terminales collecteurs, ressemblant à un paquet de raisins1,5,6. L’interstitium SMG est composé des vaisseaux sanguin et lymphatique, intégrés dans le tissu conjonctif7 contenant des nerfs parasympathiques8 et5de la matrice extracellulaire. Glandes salivaires normales humains et rongeurs contiennent également des cellules T, macrophages et cellules dendritiques9, ainsi que les plasmocytes sécrétant des immunoglobulines A (IgA) dans la salive9,10. En raison de ses fonctions aux multiples facettes de la santé et la maladie, la SMG est un sujet d’intérêt pour plusieurs domaines de la recherche biologique, y compris la dentisterie4, immunologie11, oncologie12,8de la physiologie et biologie cellulaire 3.
Imagerie des processus cellulaires dynamiques et interactions est un outil puissant dans la recherche biologique13,14. Le développement des tissus profonds d’imagerie et d’innovations inmicroscopes basées sur l’optique non linéaire (NLO), qui reposent sur la diffusion ou l’absorption de photons multiples par l’échantillon, a permis d’examiner directement les processus cellulaires en tissus complexes13 ,15. Absorption des photons multiple implique la livraison de l’énergie d’excitation totale de photons de faible énergie, quelle excitation de fluorophore limites au plan focal et permet donc une pénétration plus profonde des tissus avec le photovieillissement réduite et le bruit extérieur de mise au point excitation13,15. Ce principe est employé par microscopie biphotonique (14:00) et permet l’imagerie des spécimens fluorescentes dans les profondeurs de jusqu’à 1 mm15,16. Tandis que disponible dans le commerce 14:00 configurations sont devenus faciles à utiliser et fiable, le défi majeur pour l’imagerie intravitale est soigneusement exposer et stabiliser l’organe cible des souris anesthésiés, surtout pour l’imagerie de la série de laps de temps. Plusieurs méthodes pour la correction de dérive numérique après acquisition de données ont été publiées le17,18 et nous avons récemment mis au point « VivoFollow », un système de correction automatique, qui neutralise les tissus lente dérive en temps réel en utilisant un informatisé étape19. Toutefois, il est toujours essentiel pour haute qualité d’imagerie pour minimiser le mouvement tissulaire, en particulier les mouvements rapides causés par la respiration ou de battements cardiaques19. Procédures de préparation et de stabilisation ont été publiés pour plusieurs organes, dont la moelle épinière20foie21, peau22, poumon23et ganglion24. En outre, les modèles pour l’imagerie des glandes salivaires de rat ont été développés3,25 et peaufinées pour intravitale imagerie à haute résolution de la murine que SMG adapté à un microscope inversé installation26, 27 , 28.
Nous présentons ici un protocole pratique et adaptable pour l’imagerie de la SMG murine intravitale à l’aide de la microscopie non linéaire verticale, qui est couramment utilisée pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie. À cette fin, nous avons modifié une scène largement indépendants immobilisation utilisée pour les préparations de ganglions poplités.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole propose une approche simple pour l’imagerie in vivo des glandes salivaires sous-maxillaires et sublinguales murines microscopie non linéaire verticale souvent utilisés dans le domaine de l’immunologie. La méthode peut être adaptée pour l’imagerie des autres glandes exocrines dans la région de la tête et du cou. Par exemple, notre laboratoire a réaliser l’imagerie de la glande lacrymale de manière analogue (non illustrée).
Enlever le tissu conjonctif auto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation National Suisse (FNS) projet grant 31003A_135649, 31003A_153457 et 31003A_172994 (pour JVS) et Leopoldina bourse 2011 DFP-16 (BS). Ce travail a bénéficié des configurations optiques du « Microscopie Imaging Center » (MIC) de l’Université de Berne.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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