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Bioengineering

Canal de Microfluidic reconfiguráveis com Sidewalls Pin-diferenciado

Published: April 12, 2018
doi:
10.3791/57230
, ,
1Department of Mechanical Engineering,Shibaura Institute of Technology

Summary

Um canal de microfluidic com paredes laterais deformáveis oferece controle de fluxo, manipulação de partículas, personalização de dimensão do canal e outras reconfigurações durante a utilização. Nós descrevemos um método para fabricar um canal microfluidic com paredes laterais de uma matriz de pinos que permite que sua forma de mudar.

Abstract

Microfluidic componentes precisam ter várias formas para realizar funções diferentes microfluidic chave como mistura, separação, interceptação de partículas ou reações. Um canal de microfluidic que deforma mesmo depois de fabricação, mantendo a forma de canal permite alta reconfigurabilidade spatiotemporal. Este reconfigurabilidade é necessária em tais funções microfluidic chave que são difíceis de alcançar em sistemas existentes microfluidic “reconfigurável” ou “integrado”. Nós descrevemos um método para a preparação de um canal de microfluidic com um flanco deformável, consistindo de uma matriz alinhada lateralmente das extremidades dos pinos retangulares. Os pinos em suas direções longitudinais de actuação altera posições de fim dos pinos e, portanto, a forma das paredes laterais do canal diferenciado. Lacunas de pino podem causar vazamentos indesejados ou aderência aos pinos adjacentes causada por forças de menisco. Para fechar as lacunas de pin, introduzimos o preenchedor de lacunas baseados em suspensão de hidrocarboneto-fluoropolímero acompanhado por uma barreira elastomérica. Este dispositivo microfluidic reconfiguráveis pode gerar fluxo temporal forte no canal deslocamento, ou pode interromper o fluxo em qualquer região do canal. Este recurso facilitará, sob demanda, a manipulação de células, líquidos viscosos, bolhas de gás e não-líquidos, mesmo que sua existência ou comportamento é desconhecido no momento da fabricação.

Introduction

Dispositivos microfluídicos – tamanho micro dispositivos que controlam pequenas quantidades de líquido e os seus fluxos – oferecem miniaturização de procedimentos biomédicos em um formato de “chip” com maior portabilidade e, muitas vezes, a acessibilidade. Conforme descrito em uma recente revisão1, vários componentes microfluidic consistindo de espaços e aspectos positivos foram desenvolvidos para realizar funções fluídico básicas e fundamental como mistura, separação, interceptação de partículas ou reações.

Enquanto o comportamento de muitos dispositivos microfluídicos é determinado na fase de projeto, alguns tipos de dispositivos microfluídicos permitam alterações pós-fabricação de sua estrutura ou comportamento. Aqui nos referimos a este recurso como “reconfigurabilidade”. A reconfigurabilidade dos sistemas microfluídicos geralmente reduz o tempo e o custo necessário para projetar um dispositivo e/ou permite a personalização de layout microfluidic ou funções ao longo do tempo.

Descrito anteriormente reconfigurável microfluidic dispositivos caem em três categorias a seguir. Na primeira, deformação dos canais elastoméricas permite taxas de fluxo e direções para ser alterado durante o uso. Para ganhar a reconfigurabilidade, canais elastoméricas são deformadas por várias forças externas e controláveis, como fontes de pressão pneumática2, Braille atuadores3ou4de vedação de compressão. Na segunda, dispositivos reconfiguráveis dependem de projetos modulares, tais como multi-camada circuitos fluídico, canais modulares com magnético interconexões e microfluídica baseados em tubos de5. Na terceira, o dispositivo em si não é reconfigurável, mas microdroplet transporte no eletrodo matrizes (muitas vezes referidas como microfluídica digital)6,7 e suspensão de dispositivos microfluidic baseada em gota8 habilitar sob demanda switching do fluxo ou a rota de fluido.

No entanto, muitos destes reconfigurações são limitados a nível macroscópico e topológica. Por exemplo, muitos dispositivos microfluídicos integrado estancar ou mudam a direção do fluxo por colapso microcanais nas regiões predefinidas. No entanto, a posição e o número de regiões a ser recolhido não são possível reconfigurar. Embora a microfluídica digital tem uma variedade de habilidades de manipulação de fluidos, fluxos possíveis devem ser limitados em grande parte pelo volume de cada gota. Além disso, quando as células são cultivadas em tais gotículas de meios de cultura de células, é necessário esforço extra para evitar a evaporação e a dissipação do gás de gotículas e evitar choque de pressão osmótica e mudança brusca de pH.

Para realizar a reconfigurabilidade de nível de recurso do canal, propusemos um dispositivo microfluidic com paredes laterais móveis que consistia em conjuntos de elementos de máquina para dinamicamente reconfigurá-las quando em uso9. Para formar um flanco deformável, pequenos pinos retangulares foram alinhados para que cada extremidade dos pinos definido um segmento da parede lateral. Os pinos de deslizamento permitiu a deformação da parede lateral que permitiu o transporte ou a padronização das células, bolhas e partículas dentro do canal. Para minimizar o volume morto e maximizar reconfigurabilidade, a distância entre os pinos adjacentes tinha que ser minimizada. No entanto, forte ação capilar, agindo sobre o pequeno lacunas entre pinos conectando dentro e fora do microchannel causa do vazamento de qualquer líquido entrar a lacuna de pin, causando evaporação da mídia, contaminação bacteriana ou citotóxica e eventualmente célula morte. Portanto, nós desenvolvemos canais de vazamentos diferenciado do sidewall-tipo microfluidic reconfigurável que suportar ações pin cíclica e a longo prazo de cultura celular10.

Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para construir microfluidic dispositivo de cultura de células com um flanco diferenciado que pode ser reconfigurado seguindo o aumento gradual na área de cultura de células. Hermeticidade das paredes laterais discretos canal é testada utilizando imagens de fluorescência. A compatibilidade de cultura de células e a capacidade de padronização de célula são avaliados usando a cultura de pilha em-microplaqueta.

Este sistema de microfluidic é adequado sempre que o projeto de canal adequado não pode ser predeterminado e deve ser mudado sob demanda. Por exemplo, este sistema poderia ser usado para ajustar a taxa de largura e fluxo de canal com base no crescimento celular ou migração, de fluxo ou armadilha nematoides ativos ou outros pequenos objectos que comportar-se inesperadamente no canal, ou para aceitar várias amostras raw ou Bioprodutos que Ainda não foram concebidos no momento da concepção.

Protocol

1. gravura de pinos (Figura 2) Desengordurar pinos retangulares por imersão em acetona. Passivate os pinos por imersão em 4 mL de ácido nítrico a 10% e, em seguida, aquecer a solução a 65 ° C por 30 min no forno. Proceda à sonicação os pinos em água desionizada por 5 min remover o ácido residual e seque com uma toalha de papel. Mergulhe os pinos em 0,5 mL de agente de liberação de molde para 2 h.Sonicate os pinos em água desionizada por 5 min. Fabrica um prato de gravura (Figura 2C). Desenhe ou escreva duas linhas paralelas com uma lacuna de 4 mm em um slide de vidro usando uma régua. Aplique um adesivo resistente a produtos químicos e de baixa viscosidade para uma superfície de dois retangular corte esfregaços. Ligação os dois esfregaços de corte sobre a lâmina de vidro em um espaço de 4 mm. Use a linha paralela como um guia. Dispense a duas linhas de adesivo de silicone sobre o prato de gravura (ver Figura 2C para a posição e o tamanho do contorno).Nota: Um modelo 3D-impresso (um arquivo de modelo STL é incluído como um material suplementar) ajudará a desenhar linhas facilmente e com precisão. Colocar os pinos do prato de gravura para que as dicas de 2 mm de comprimento em suas extremidades retas estão imersos no teste padrão linha adesivo. Dispense o adesivo novamente para garantir que os pinos são completamente cobertos e desenhar um contorno. Transferir a cápsula da gravura para um fermentador umidificado aquecida a 38 ° C. Espere para curar o adesivo durante a noite. Adicione 0,2 mL de ácido nítrico 0,5 M a 0,2 mL de ácido clorídrico de 5,0 M lentamente em um frasco de vidro.Atenção: A mistura, também conhecida como água régia, é muito corrosivo e potencialmente explosivas. Usar luvas de borracha à prova de ácido e óculos de segurança e agir com extrema cautela ao manusear ácidos. Nunca guarde a solução. Reduza o ácido nítrico possível para diminuir sua agressividade. Coloque o prato de gravura sobre uma placa aquecida a 65 ° C. Despeje a 0,4 mL da mistura de ácido sobre a região descoberta dos pinos. Espere 10 minutos e transferir o ácido para uma proveta. Neutralize todo o ácido restante incluindo região gravado dos pinos com 5 mL de solução 0,8 M de bicarbonato de sódio em água desionizada. Retire os pinos do prato de gravura puxando os pinos longitudinalmente com uma pinça. Proceda à sonicação os pinos em água desionizada para 5 min, seguido por sonication na acetona por 5 min. Passivate região gravada dos pinos como na etapa 1.2. Verificar a largura dos pinos gravados com um microscópio de loja com um retículo. Ajustar o tempo de condicionamento descrito no 1.7, para que a largura da região gravada é de ± 0,2 mm 0,02. Transferi os pinos para um frasco de vidro contendo 5 ml de etanol a 70%. Trazer o frasco para uma capa laminar. Pegar os alfinetes do frasco e deixe-as secar. 2. fabricação de placa de Silicone com reservatórios e um espaço para os pinos. Fabrica um molde para um espaço de pinos e uma parede lateral fixa por processos típicos de litografia. Casaco de uma lâmina de vidro desengordurados com 1 mL de epóxi negativo fotorresiste usando um aplicador de rotação em 1.000 rpm. Seca o fotorresiste num prato quente de 95 ° C por 15 min. Repita este passo uma vez. Gire o casaco a terceira camada da mesma fotorresiste a 2.000 rpm no slide vidro com fotorresiste revestido. Seque o fotorresiste uma placa de 95 ° C por 30 min. Expor a camada fotorresiste para 450 mJ/cm2 de 365 nm luz ultravioleta de uma fonte de luz UV local através de um filme de photoplotted. Asse o fotorresiste exposta uma placa de 95 ° C por 15 min. desenvolver o fotorresiste por pulverização de um solvente (acetato de 2-metoxi-1-metiletil) usando um pulverizador de mão e secar com gás nitrogênio. Coloque a lâmina de vidro com fotorresiste estampado no fundo de um prato de plástico. Encham o pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) o molde para uma espessura de 3 mm. Retirar todas as bolhas do pré-polímero PDMS num exsicador de vácuo a-800 kPa durante 10 min. Cure o pré-polímero PDMS em estufa a 65 ° C por 1 h. Demold a laje PDMS parcialmente curada usando um bisturi. Totalmente cure o PDMS em estufa a 120° C, durante 1 h. Ao longo do padrão de orientação, guarnição fora bordas irregulares de laje PDMS com o mesmo bisturi. Tornar mais precisas e limpar um corte quanto possível, particularmente na superfície que define a ranhura de inserção(ver Figura 1)para os pinos. Perfura 2 furos mm de diâmetro para a entrada/saída nas extremidades do canal principal da laje PDMS usando socos de biópsia. Da mesma forma, perfure furos de mm-diâmetro do espelho 1 nas extremidades do canal de ventilação de ar. Consulte a Figura 1A para o layout do canal e a posição dos buracos. 3. montagem do dispositivo com fabricação In loco de preenchedor de lacunas e barreira. Fabrica um assembly microchannel. Mergulhe um 10 × 20 mm n º 4 lamela em uma solução de limpeza aquecida a 60 ° C por 10 min. Lave os esfregaços com água desionizada duas vezes e seque a 120 ° C por 10 min. A laje PDMS para uma lamela de plasma-vínculo: Coloca a laje PDMS (canal recurso para cima) e a limpa 10 × de 20 lamela mm n º 4 na câmara de vácuo de um sputter coater. Comece a bombear para baixo da câmara de vácuo-plasma do 60 PA. gerar ar (20 mA) por 30 s. Imediatamente da ventilação da câmara. Bond do lado de recurso do canal do PDMS laje para a lamela com suas bordas alinhadas. Coloque as camadas coladas em um forno de 65 ° C por 10 min. Traga as camadas coladas a uma capa laminar usando um recipiente estéril. Esterilizá-los com a luz UV durante 30 min. No bairro laminar, inserir os pinos do slot para que suas extremidades formam a outra lateral da microchannel. Os pinos adjacentes devem ser diferentes de comprimento para evitar o contato de duas pontas verticais (veja Figura 1B). Grande espaçamento entre as extremidades verticais é preferível. Um espaço de (N-1) × (pino largura) é possível quando preparam-se N tipos de pinos com comprimentos diferentes pinos (L na Figura 2). Fabrica uma base ( Figura 2B). Fazer ou ler um arquivo de parte da base e fazer dois arquivos de controle numérico (NC) (contendo percursos; incluídas como material suplementar) utilizando software CAD/CAM. O primeiro arquivo suplementar de NC usa um moinho de extremidade mm de diâmetro 4 e o segundo moinho acabar com um 1 mm de diâmetro. Braçadeira de uma prancha de 3 mm de espessura clara polimetilmetacrilato (PMMA) para um moinho CNC. Abra o primeiro arquivo NC no controlador de um moinho de NC (CNC) do computador. Instalar um moinho de extremidade de 4 mm para o moinho CNC e localizar parte zero tocando o moinho de extremidade à diretoria PMMA. Execute o código NC para cortar a placa.Nota: Ocasionalmente explodir a ponta do moinho de final com ar comprimido para remoção de resfriamento e chip. Repita 3.2.3 usando o segundo arquivo NC e um moinho de extremidade de 1 mm. Desengraxe de peças usinadas com detergente e seque com uma toalha de papel. Pulverize as peças com 70% de etanol e trazê-los para uma capa laminar. Fabrica um preenchedor de lacunas de pino e elastomérica barreira:Nota: Passos 3.3.1 – 3.3.7 devem ser realizados em condições assépticas numa vizinhança de laminar. Prepare o preenchedor de lacunas pela mistura de petrolato branco e pó de politetrafluoroetileno, na proporção de 2:1 em peso. Homogeneizar a mistura usando um homogeneizador ultra-sônico. Despeje o preenchedor de lacunas em uma seringa de distribuidor. Inserir um êmbolo e empurrá-lo para encher a ponta da seringa. Anexar uma agulha e empurre o êmbolo novamente até que a ponta da agulha é preenchida. Da mesma forma, preparar uma seringa dispensador com um êmbolo e uma agulha e encha com adesivo de silicone. Conecte cada seringa de um dispensador pneumático usando um tubo adaptador. Ajuste as pressões de distribuição para enchimento de 250 kPa e 280 kPa e adesivo de silicone. Dispense o adesivo de silicone para a borda de um bolso da base. Coloque um 10 × 20 mm no. 4 lamela no bolso e pressione-o firmemente para criar laços. Dispense o adesivo de silicone, a uma profundidade de aproximadamente 1 mm desenhar dois segmentos ao longo de dois slots exteriores da base. Dispense o preenchedor de lacunas, a uma profundidade de aproximadamente 1 mm, para desenhar segmentos ao longo do outro slot. Dispense o adesivo de silicone para a borda do outro bolso. Coloque uma montagem microchannel (3.1) no bolso e pressione-o firmemente para criar laços. Repita 3.3.5 para garantir que tanto o preenchedor de lacunas e o adesivo de silicone incorporar totalmente os pinos e que não há nenhuma abertura no caça-níqueis. Colocar o aparelho em um recipiente estéril como uma caixa de aço inoxidável com tampa. Transferir o recipiente para um fermentador umidificado aquecida a 38 ° C. No bairro laminar, cure a barreira elastomérica por um dia. Mova cada pino até 1 mm ao longo de pinos adjacentes para liberar os pinos da barreira elastomérica curado. Esterilize o dispositivo com luz UV durante 30 min. 4. avaliação do dispositivo Microfluidic Detectar vazamento usando fluorescência Abra o microchannel usando uma ferramenta fina ou um robô de área de trabalho. Fazer a largura do canal como consistente ao longo do canal quanto possível. Dilua uma tintura fluorescente verde com água desionizada a 10 µM para fazer solução de fluorescência. Adicione solução de fluorescência de uma das portas da final da microchannel com um micropepitador. Esta etapa irá preencher o canal com a solução. Coloca o dispositivo microfluidic e dois pedaços de papel absorvente molhado com água deionizada em um prato grande de plástico. Incube o prato em 37 ° C e 5% CO2 pelo menos 24 h. Gravar imagens de fluorescência verde do microchannel com um microscópio fluorescente invertido com uma câmera de microscópio. Abra as imagens fluorescentes com um software de análise de imagem apropriada e confirmar que não há nenhum escapamento (fluorescência verde) na interface do preenchedor de lacunas e os pinos. Células de semente para o microchannel. Prepare um recipiente de cultura de células contendo confluentes em 70-80% (dependendo de tipos de células). Desanexar e suspender as células em meio de crescimento. Centrifugar as células (a velocidade e o tempo dependem de tipos de células) e aspire o meio. Ressuspender as células com uma pequena quantidade do meio. Contar as células com um contador de célula e ajustar a densidade de células de 1,5 × 106 a 1,5 × 107 células/mL. Abra o microchannel usando uma ferramenta fina ou um robô de área de trabalho (Figura 1B) para fazer um canal direto de 400-µm de largura. Ajuste as posições de pino para tornar a parede lateral como plana ao longo do canal quanto possível. Adicionar a suspensão de células para um do porto final do microchannel e encher o canal. Localize um dos pinos que define a parede lateral da região para iniciar a cultura. Sob um microscópio invertido, feche os dois pinos adjacentes para incluir células na região de cultura celular. Feche todos os pinos na ordem do interior para o exterior para expulsar todas as células do canal. Suavemente aspirar suspensão dos portos final e adicionar-lhes médio. Incube o dispositivo conforme descrito em 4.1.4. Quando as células são cerca de 70-80% confluentes, lentamente abra um pin para ampliar a área de cultura.

Representative Results

A construção do microchannel reconfigurável é mostrada na Figura 1. Múltiplos pinos retangulares foram colocados sobre um substrato de vidro e estavam alinhados para que lado longo dos pinos estava em contato. Uma folha PDMS com perfurados buracos e um recesso da mesma profundidade que a altura do pino coberto as extremidades dos pinos para formar os reservatórios de entrada/saída de canal, canal teto e outra parede lateral oposta à parede do canal que consistia dos pinos. Região cercada por pinos, uma parede (uma das faces da folha de PDMS) e o substrato de vidro formam um canal microfluidic. Como descrito anteriormente, a reconfigurabilidade do sistema proposto microfluidic é alcançada por muitos pequenos pinos colocados em paralelo com lacunas muito pequenas, mas diferente de zero. O problema em relatórios anteriores foi o forte fluxo gerado pelas frestas pelo efeito capilar. Para superar este problema, as lacunas primeiro foram preenchidas com um preenchedor de lacunas. Neste protocolo, uma mistura de dispersão de hidrocarbonetos viscoso e fluoropolímero pó foi usada como um preenchedor de lacunas. No entanto, o preenchedor de lacunas em si também está sujeito ao efeito capilar. Portanto, conforme mostrado na Figura 1, o resultante microchannel reconfigurável tem hidrocarbonetos/fluoropolímero preenchedor de lacunas e uma barreira elastomérica formado em torno do perímetro exterior do preenchedor de lacunas. No meio dos pinos de diluição é necessária para acomodar uma quantidade suficiente de preenchedor de lacunas para garantir a espessura e a força da barreira elastomérica entre dois pinos. Figura 2 A mostra um desenho de um alfinete que forma um segmento de parede lateral. Classe de aço inoxidável 316L foi selecionada como o material devido ao seu resistente à corrosão e baixa lixiviação Propriedades. No entanto, um processo de passivação extra foi necessário compatibilizar a cultura de pilha de pinos. Um pino deve ter uma ponta precisamente retangular sem rebarbas com êxito, formar um segmento de parede lateral. Além disso, um pino deve ter uma “alça” para que o pino pode ser facilmente movido empurrando a pega. Porque cada pino tem um meio estreito, a espessura do elastômero entre pinos foi o suficiente para suportar o cisalhamento causado pelo movimento do pino. Ao contrário de outras peças, contendo o dispositivo, a fabricação de pinos, exceto emagrecimento médio, deve ser ordenada de uma empresa especializada em descargas elétricas usinagem (EDM), porque é um dos métodos mais precisos e cost-effective de usinagem de pequeno as peças feitas de metais duros. Realizar desbaste médio pela gravura se reduz o custo de usinagem e o risco de dobrar ou quebrar durante a usinagem. Para confirmar que o preenchedor de lacunas, a barreira elastomérica e eventualmente a impermeabilidade do microchannel reconfigurável função corretamente, utilizou-se a detecção de vazamento por fluorescência. A Figura 3 mostra uma imagem de fluorescência da área perto da borda da barreira elastomérica 3 dias depois o microchannel foi preenchido com água contendo corante marcador fluorescente. A imagem de fluorescência que mostra o líquido de enchimento o canal atingido uma profundidade de cerca de 200 µm da borda visível da barreira elastomérica. No entanto, o líquido não chegou a lacuna enchimento. Além disso, não observou-se nenhum escapamento do preenchedor de lacunas através da barreira elastomérica. Esta observação indica que o ajuste apertado entre o meio estreito dos pinos e elastomérica barreira impediu a migração de líquido pelas frestas. Finalmente, realizamos cultura celular de longo prazo com a área de cultura adaptada expandindo gradualmente a parede lateral do dispositivo reconfigurável microfluidic conforme mostrado na Figura 4. D 0, um pequeno número de células foram confinado dentro de um espaço igual a um pino de largura e outras células foram aspiradas. D 2, as células foram anexadas à superfície inferior e começaram a proliferar. Dois pinos foram retraídos para que todas as células eram claramente visíveis, embora a confluência foi ainda baixa. Na 5D, as células continuaram a proliferar e a confluência aumentou. Em 6 e 9 d, dois outros pinos foram retraídos para manter o underconfluent de células. O efeito da expansão gradual da área de cultura é mostrado na Figura 4B. Houve mudanças súbitas da densidade celular no dia que do pin(s) foram retraídos. No entanto, a taxa de crescimento da contagem de células foi mantida constante, enquanto que vi na cultura de pilha típica é exponencial. Figura 1 : Dispositivo microfluidic reconfiguráveis com uma parede lateral diferenciado-pin. (A) peças e construção de um dispositivo microfluidic reconfigurável. O dispositivo tem um canal direto com uma parede lateral, formado pelas extremidades de 10 pinos de aço inoxidável inseridos no PDMS/vidro microchannel características. Preenchedor de lacunas e uma barreira elastomérica impede líquido vazando pelas frestas pin. Esfregaços, preenchedor de lacunas e a barreira de elastómero são fixos para um polimetilmetacrilato (PMMA) base. (B) Automated pin manipulator. Um efetor final feito de uma folha de metal é fixado para um robô de área de trabalho de 3 eixos. Para mover um pino, o efetor final empurra sua extremidade vertical. Pinos com comprimentos diferentes são colocados em um intervalo de três vezes a largura do pino. O intervalo que garante o fim effector companheiros um pino de uma só vez com espaço suficiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Desenho mecânico de peças usinadas usado no protocolo. As unidades são em milímetros; R indica uma dimensão de raio; o símbolo quadrado (□) indica características quadradas; t indica a espessura. (A) um 316L inoxidável aço pino como uma parte da parede lateral. Os pinos podem ser ordenados e usinados conforme descrito. Afinamento do meio pin tornar formas semelhantes a osso de cão não é refletida neste desenho porque isso não foi ordenado como parte de usinagem mas foi realizado como parte do protocolo. (B) uma base de polimetilmetacrilato (PMMA) que prende os esfregaços, preenchedor de lacunas e elastomérica barreira no lugar contra o movimento do pino. (C) um prato de gravura que é usado para gravar no meio dos pinos. Para criar um prato de gravura, quatro pedaços de vidro são ligados usando o adesivo de silicone. Um padrão de adesivo de silicone de contorno é desenhado sobre o prato, seguido pela colocação dos pinos no prato conforme mostrado no desenho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Deteção de fluorescência de escapamento de um microchannel reconfigurável através de aberturas de pin. Imagem de fluorescência do corante verde fluorescente, enchendo o microchannel reconfigurável é sobreposta em uma imagem de contraste de fase da estrutura do selo, que consiste de um preenchedor de lacunas (opaco) e elastomérica barreira (translúcida). Uma vantagem da barreira de elastômero é visível como características de menisco e é indicada por uma linha pontilhada superior; a interface entre o enchimento de barreira e gap de elastômero é mostrada como características de menisco que entre em contato com a área preta e é indicada pela linha pontilhada inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Crescimento de células contínuo e progressivo com a área de cultura de célula variável em um microchannel reconfigurável. (A) crescimento de células COS-7 em uma área de cultura de célula confinada, movendo as paredes laterais. (B) crescimento curva e tempo de evolução da densidade de células COS-7 confinados em áreas de tamanho variável cultura no microchannel reconfigurável apresentado na). Três setas verticais denotam a expansão da área de cultura de células em 2, 5 e 6 d, respectivamente. Além de contagem de células, as densidades de célula são mostradas para as mesmas áreas de cultura, equipados individualmente para cada curva de crescimento exponencial e usado para estimar o tempo de duplicação local (td [h]) mostrado nos quadros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O microchannel pin-diferenciado é um canal completo microfluídicos, e acreditamos que tem obviamente alta reconfigurabilidade em forma de canal em comparação com qualquer canais microfluídicos existentes. Nós fornecemos aqui o protocolo permitirá microfluidic dispositivos capazes de cultura de células com gradualmente expandindo a área de superfície de cultura celular para manter as culturas sob confluência para uma longa duração. O dispositivo também irá fornecer a padronização no canal de células sem padronização proteínas sobre o substrato de antemão ou de qualquer outra consideração, no momento de concepção ou de fabricação. Além disso, este dispositivo reconfigurável microfluidic facilmente gera fluxo forte deslocamento no canal, que ajudaria a implementar manipulação de tais materiais de difícil-para-fluxo que muito poucos microfluidic existente dispositivos podem manipular. Isto significa que a interação entre as células e outros microorganismos, gases e outros fluidos-não pode ser avaliada usando este dispositivo sem grandes modificações no projeto do dispositivo.

Nós consideramos aplicando Laplace pressão ou pressão hidrostática para uma entrada do canal, como métodos de controle de fluxo externo. Não recomendamos empurrando o líquido em um beco sem saída, porque ele irá gerar fluxo para o canal de ventilação de ar com as aberturas entre os pinos e piso/teto do canal. Muitas operações de fluido não exigem tais operações de pino. Por exemplo, a mistura pode ser realizado por triturar o líquido por um pino (ou seja, movendo-se apenas um pino para a frente e para trás várias vezes).

As partes mais críticas do dispositivo são os pinos. Precisão de comprimento, paralelismo, perpendicularidade e qualidade de superfície são necessárias para os pinos, como eles devem formar um microchannel, devem mover suavemente e devem orientar a circulação de pinos adjacentes. Portanto, recomendamos que os pinos devem ser ordenados de uma empresa especializada em usinagem de precisão, mediante a apresentação de um desenho semelhante à Figura 2. Pode haver empresas que exigem Dimensionamento geométrico adicionais e instruções explícitas rugosidade da superfície. No entanto, os pinos são reutilizáveis, se forem manuseados com cuidado e ocasionalmente passivados com ácido nítrico.

A barreira elastomérica é outra característica crítica, e sua formação é o passo mais crítico nos processos de fabricação do dispositivo. Uma base precisamente usinada serão necessários para obter resultados confiáveis e reproduzíveis. Colocar os pinos na barreira não polimerizada é também um passo crítico. Os pinos devem ser mantidos bem alinhados e incorporado no preenchedor de lacunas e a barreira sem bolhas de ar. Estas etapas evitar o vazamento através dos pinos, que é um problema comum com este dispositivo microfluidic.

Outros problemas comuns no uso deste dispositivo são pinos um) frictionally contidos e morte de células b) e a taxa de crescimento baixo. Possíveis causas para estas em um) incluem desigual (ondulada ou cônica) gravura da qualidade média, pobre pin do desajustado, superficial e dimensional gravado entre a altura da ponta de pinos e a altura da camada de fotorresiste em um molde para as lajes do silicone. Ajuste da formulação etchant, temperatura e agitação pode ajudar a melhorar o movimento do pino. Além disso, julgamento de encaixe sem usar cera ou adesivo irá fornecer dicas para resolver o problema. Possíveis fatores em b) são insuficiente passivação dos pinos, erros na seleção de adesivos para barreiras elastoméricas e cura incompleta dos adesivos. Algumas células podem exigir revestimento dentro o microchannel com fibronectina ou outras proteínas ou polímeros que promovem a adesão celular. Além disso, a otimização na prática de cultura celular como tripsinização e centrifugação diminuirá células mortas no microchannel.

Uma das limitações do protocolo de fabricação apresentados é que apenas uma das paredes laterais é diferenciada. A reconfigurabilidade do canal vai melhorar ainda mais, se ambas as paredes laterais são construídas por matrizes de pino. Embora que requer o dobro da quantidade de pinos e mais etapas de fabricação, esta é uma opção tecnicamente viável.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo KAKENHI (20800048, 23700543).

Materials

Oven Yonezawa MI-100
10% Nitric Acid Wako Chemicals 149-06845
Stainless steel pins Micro Giken N/A 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM
Mold release agent Fluoro Technology FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS) Shin-Etsu Chemicals KE-106
Negative epoxy photoresist Nippon Kayaku SU-8 3050
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 26 x 60mm No.4
Acetone Kanto Chemicals 01060-79
Glass slides (Large) Matsunami Glass 76 x 52mm No.1
Silicone adhesive Shin-Etsu Chemicals KE-41
White petrolatum Nikko Rica Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder Power House Accele Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-thick) Various N/A
Pneumatic dispenser Musashi Engineering ML-5000XII
Hydrochloric acid Kanto Chemicals 180768-00
Computer numerical control (CNC) mill Pro Spec Tools PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0100
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) Cotronics Duralco 4460
Borisilicate glass vials Various To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass.
Sodium bicarbonate Kanto Chemicals 37116-00
Ultrasonic cleaner AS ONE AS12GTU
Ultrasonic drill Shinoda Tools SOM-121 Used as a ultrasonic homogenizer.
Spin coater Active ACT-220DII
Hotplate AS ONE ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi) Unno Giken N/A Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted.
2-methoxy-1-methylethyl acetate Wako Chemicals 130-10505
UV spot light source Hamamatsu L8327 Ultraviolet source
Nitrogen Various N/A
Vacuum desiccator and pump AS ONE MVD-100, GM-20S
Scalpels Various No.11
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) Kai Medical BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glass engraving pen Various N/A
Cleaning solution Tama Chemicals TMSC Dilute 1:100 with deionized water
Sputter coater San-yu Electron SC-708 For plasma bonding.
Dispenser syringe (5 ml) Musashi Engineering PSY-5E
Plunger Musashi Engineering FLP-5E
Blunt needle (21G) Musashi Engineering PN-21G-B
Adapter tube Musashi Engineering AT-5E
Fermenter Japan Kneader PF100
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) Thermo Fisher A33077
Large plastic dish Greiner bio-one 688161
Absorbent paper Asahi Kasei BEMCOT M-1
Inverted microscope Leica DMi8
Microscope camera Qimaging Retiga 2000R
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) GE Health Care SH30021.01
Antibiotic-antimycotic solution Thermo Fisher 15240-062
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher 25200-056
Phosphate buffered saline (PBS) GE Health Care SH30256.01
Fetal bovine serum (FBS) Biowest S1820
Cell counter FPI OC-C-S02
Cell culture vessel VIOLAMO VTC-D100
15 ml conical tube Corning 352095
Shop microscope PEAK 2034-20
Hand sprayer FURUPLA No.3530
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 10 x 20mm No.4
CAD/CAM software Autodesk Inventor HSM
Nitrogen gas pressure regulator AS ONE GF1-2506-RN-V Set to 0.1 MPa
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References

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Futai, N., Fujita, K., Ikuta, W. Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls. J. Vis. Exp. (134), e57230, doi:10.3791/57230 (2018).
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