Reconfigurable canal microfluidique avec flancs Pin-discrétisé

1. gravure à l’eau-forte de broches (Figure 2A) Dégraisser les broches rectangulaires par immersion dans de l’acétone. Passiver les broches en immergeant dans 4 mL d’acide nitrique 10 %, puis chauffer la solution à 65 ° C pendant 30 min dans un four. Laisser agir les tiges dans l’eau désionisée pendant 5 min enlever l’acide résiduel et sécher avec une serviette en papier. Plongez les tiges dans 0,5 mL d’agent de démoulage du moule pour 2 h.Sonicate les tiges dans l’eau désionisée pendant 5 min. Fabriquer un plat de gravure (Figure 2C). Dessinez ou inscrire deux lignes parallèles avec un écart de 4 mm sur une lame de verre à l’aide d’une règle. Appliquer un adhésif résistant aux produits chimiques et faible viscosité à une surface de deux rectangulaire, coupée des lamelles couvre-objets. Coller les deux lamelles couvre-objets coupés sur la lame de verre à un écart de 4 mm. Utiliser la ligne parallèle comme un guide. Dispense de deux lignes de colle silicone sur le plat de gravure (voir Figure 2C pour la position et la taille du contour).Remarque : Un modèle 3D-imprimés (un fichier de modèle STL est inclus comme un matériau supplémentaire) permettra de tracer des lignes facilement et avec précision. Mettre les chevilles sur le plat de gravure afin que les conseils de 2 mm de long sur leurs extrémités droites sont immergés dans le motif de trait adhésif. Diluer la colle encore à faire en sorte que les broches sont entièrement recouvert et dessiner un contour. Placer la capsule de la gravure d’un fermenteur humidifié chauffé à 38 ° C. Attendre la nuit pour polymériser la résine. Ajouter 0,2 mL d’acide nitrique 0,5 M à 0,2 mL d’acide chlorhydrique 5,0 M lentement dans un flacon en verre.ATTENTION : Le mélange, également connu sous le nom de l ‘ eau régale, est très corrosif et potentiellement explosif. Porter des gants en caoutchouc résistant aux acides et des lunettes de sécurité et soyez extrêmement prudent lorsque vous manipulez des acides. Ne rangez jamais la solution. Réduire l’acide nitrique que possible pour diminuer son agressivité. Mettre le plat de la gravure sur une plaque chauffée à 65 ° C. Versez 0,4 mL du mélange acid sur la région découverte des broches. Attendez 10 min et transférer de l’acide dans un becher. Neutraliser tout l’acide restant, y compris la région gravée des broches avec 5 mL de solution de bicarbonate de sodium 0,8 M dans l’eau désionisée. Enlever les tiges de la capsule de la gravure en tirant sur les broches longitudinalement avec des pincettes. Laisser agir les tiges dans l’eau désionisée pendant 5 min, suivie par sonication dans l’acétone pendant 5 min. Passivation de la région gravée des broches comme à l’étape 1.2. Vérifier la largeur des broches gravés avec un microscope de boutique avec un réticule. Ajuster le temps de gravure décrit dans 1,7 afin que la largeur de la région gravée soit 0,2 ± 0,02 mm. Transférer les broches dans un flacon en verre contenant 5 ml d’éthanol à 70 %. Apporter le flacon à une hotte laminaire. Ramasser les broches sur le flacon et laissez-les sécher. 2. fabrication de dalle de Silicone avec réservoirs et un espace pour les broches. Fabriquer un moule pour un espace des épingles et une paroi fixe en procédés lithographiques typiques. Recouvrir d’une lamelle de verre dégraissés avec 1 mL de photorésine époxy négatif en utilisant une coucheuse essorage à 1000 tr/min. Sécher la résine photosensible sur une plaque chauffante de 95 ° C pendant 15 min. répéter cette étape une fois. Faites tourner le manteau la troisième couche de la photorésine même à 2 000 tr/min sur la lame de verre avec enduit résine photosensible. Sécher la résine photosensible sur une plaque chauffante de 95 ° C pendant 30 min. Exposer la couche de résine photosensible à 450 mJ/cm2 de 365 nm lumière ultraviolette d’une source lumineuse spot UV à travers un film de photoplotted. Faire cuire la photorésine exposée sur une plaque chauffante de 95 ° C pendant 15 min. mettre au point la résine photosensible en pulvérisant un solvant (acétate de 2-méthoxy-1-méthyléthyl) à l’aide d’un pulvérisateur à main et séchez à l’azote. Placer la lame de verre avec motifs résine photosensible au fond d’un plat en plastique. Verser prépolymère de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur le moule d’une épaisseur de 3 mm. Détente du prépolymère de PDMS dans un dessiccateur à vide à-800 kPa pendant 10 min. Guérir le prépolymère de PDMS dans un four à 65 ° C pendant 1 h. Demold la dalle PDMS partiellement polymérisée à l’aide d’un scalpel. Complètement guérir le PDMS dans un four à 120° C pendant 1 h. Suivant le modèle de la ligne directrice, tailler les bords irréguliers à l’extérieur de la dalle PDMS avec le scalpel même. Rendre le plus précis et nettoyer une coupure possible, en particulier à la surface qui définit la fente d’insertion (voir Figure 1A) pour les broches. Percer 2 trous de mm de diamètre pour l’entrée/sortie dans les extrémités du chenal principal de la dalle PDMS à l’aide de poinçons de biopsie. De même, perforer des trous mm-dimeter 1 aux extrémités de la canal d’évacuation d’air. Voir Figure 1A pour la mise en page du canal et la position de ces trous. 3. montage de l’appareil avec Fabrication sur Place de Gap Filler et barrière. Fabriquer une Assemblée de microcanaux. Plonger un 10 × 20 mm n ° 4 lamelle dans une solution de nettoyage chauffée à 60 ° C pendant 10 min. Rincez les lamelles couvre-objets avec de l’eau désionisée deux fois et sécher à 120 ° C pendant 10 min. Plasma-bond la dalle PDMS à une lamelle : Placer la dalle de PDMS (côté de fonction canal vers le haut) et la nettoyer 10 × 20 mm n ° 4 lamelle dans la chambre à vide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique. Recommencer à pomper vers le bas de la chambre à 60 plasma sous vide PA. générer air (20 mA) pendant 30 s. Immédiatement, aérer la chambre. Bond du côté de fonctionnalité de canal de la PDMS de dalle de la lamelle avec leurs bords alignés. Placer les couches sous douane dans un four à 65 ° C pendant 10 min. Apporter les couches collés à une hotte laminaire à un récipient stérile. Les stériliser avec lumière UV pendant 30 min. Dans la hotte laminaire, insérez les broches dans la fente, afin que leurs extrémités forment l’autre flanc du microcanaux. Pins adjacentes devraient être différentes dans la longueur pour éviter le contact des deux extrémités verticales (voir Figure 1B). Grand espacement entre les extrémités verticales est préférable. Un espace de (N-1) × (épaisseur de la tige) est possible lorsque N types de broches avec des longueurs différentes broches (L en Figure 2A) sont préparés. Fabriquer une base ( Figure 2B). Faire ou de lire un fichier de composant de la base et deux fichiers de commande numérique (NC) (présentant les trajectoires d’outil, inclus en tant que matériau supplémentaire) à l’aide de logiciels de CFAO. Le premier fichier NC supplemental utilise un 4 mm de diamètre fin mill et le second un 1 mm de diamètre fin moulin. Fixer une planche de 3 mm d’épaisseur claire polyméthacrylate de méthyle (PMMA) sur une CNC mill. Ouvrez le premier fichier NC sur le contrôleur d’une usine de NC (CNC) d’ordinateur. Installer une usine de fin de 4 mm jusqu’à l’usine CNC et localisez la partie nulle en touchant le moulin de la fin pour le jury de PMMA. Exécutez le code NC pour couper le jury.NOTE : Parfois souffler la pointe de moulin de fin à l’air comprimé pour l’enlèvement de refroidissement et de la puce. Répétez 3.2.3 utilisant le deuxième fichier de NC et un moulin de fin 1 mm. Dégraisser les pièces usinées avec un détergent et sécher avec une serviette en papier. Pulvériser les pièces avec l’éthanol à 70 % et les apporter à une hotte laminaire. Fabriquer une broche écart remplisseur et la barrière en élastomère :Remarque : Les étapes 3.3.1 – 3.3.7 devraient être effectuées stérilement dans une hotte laminaire. Préparer remplisseur de gap en mélangeant de la vaseline blanche et poudre de polytétrafluoroéthylène à un ratio de 2:1 en poids. Homogénéiser le mélange à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons. Versez remplisseur d’écart dans une seringue de distributeur. Insérer un piston et poussez-le pour occuper la pointe de la seringue. Poser une aiguille et appuyez à nouveau sur le piston jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille est remplie. De même, préparez une seringue de distributeur avec un piston et une aiguille et remplir avec de la colle silicone. Connectez chaque seringue dans un distributeur pneumatique à l’aide d’un tube de l’adaptateur. Ajuster la pression de distribution pour adhésif siliconé et garniture pour 250 kPa et 280 kPa. Pipeter adhésif siliconé au bord d’une poche de la base. Placez un 10 × 20 mm n ° 4 lamelle sur la poche et pressez-le fermement à se lier. Diluer la colle silicone jusqu’à une profondeur d’environ 1 mm pour dessiner des segments de deux le long de deux fentes extérieures de la base. Pipeter remplisseur de fossé d’une profondeur d’environ 1 mm, pour dessiner des segments le long de l’autre emplacement. Diluer la colle silicone au bord d’une autre poche. Placer un assemblage de microchannel (3.1) sur la poche et pressez-le fermement à se lier. Répétez 3.3.5 pour s’assurer que remplissage écart tant adhésif siliconé entièrement intègrent les broches et qu’il n’y a pas d’ouverture dans les fentes. Mettre l’appareil dans un contenant stérile comme une boîte en acier inoxydable avec couvercle. Transférer le conteneur dans un fermenteur humidifié chauffé à 38 ° C. Dans la hotte laminaire, guérir la barrière en élastomère pour une journée. Déplacer chacun broches jusqu’à 1 mm le long des pins adjacentes pour libérer les broches de la barrière en élastomère durcie. Stériliser l’appareil avec la lumière UV pendant 30 min. 4. evaluation du dispositif microfluidique Détecter une fuite à l’aide de fluorescence Ouvrez le microcanaux en utilisant un outil fin ou un robot de bureau. Vérifiez la largeur du chenal comme cohérent tout au long de la chaîne possible. Diluer un colorant fluorescent vert avec de l’eau déionisée à 10 µM pour faire la solution de fluorescence. Ajouter la solution de fluorescence à l’un des ports fin du microcanaux avec une micropipette. Cette étape se remplira le canal avec la solution. Mettre le dispositif microfluidique et deux morceaux de papier absorbant mouillé avec de l’eau déionisée dans un grand plat en plastique. Incuber le plat à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 24 h. Enregistrer des images de fluorescence verte de la microchannel avec un microscope inversé à fluorescent avec une caméra microscope. Ouvrir les images fluorescentes avec le logiciel d’analyse de l’image appropriée et confirmer qu’il n’y a pas de fuite (fluorescence verte) à l’interface de la soutireuse de gap et les broches. Cellules de semences pour le microcanaux. Préparer un récipient de culture cellulaire contenant confluentes à 70-80 % (en fonction des types de cellules). Détacher et suspendre les cellules dans un milieu de croissance. Centrifuger les cellules (la vitesse et le temps dépendent de types de cellules) et aspirer le milieu. Remettre en suspension les cellules avec une petite quantité du médium. Compter les cellules avec un compteur de cellules et d’ajuster la densité cellulaire de 1,5 × 106 à 1,5 × 107 cellules/mL. Ouvrez le microcanaux en utilisant un outil fin ou un robot Bureau (Figure 1B) pour faire un canal droit 400 µm-échelle. Ajustez les positions de broches pour faire le flanc comme plat tout au long de la chaîne possible. Ajouter suspension cellulaire à l’un du port de la fin de la microchannel et remplir le canal. Localisez l’une des broches qui définit la paroi latérale de la région pour démarrer la culture. Sous un microscope inversé, fermer les deux tiges adjacentes pour enfermer des cellules dans la région de culture de cellules. Fermez toutes les goupilles d’afin d’intérieure extérieure d’expulser toutes les cellules du canal. Doucement aspirer suspension depuis les ports de la fin et leur ajouter des moyennes. Incuber le dispositif tel que décrit dans 4.1.4. Lorsque les cellules sont environ 70-80 % confluentes, ouvrir lentement un NIP afin d’élargir la zone de culture.