JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Reconfigurable mikrosıvısal kanal Pin discretized yanağında ile

Published: April 12, 2018
doi:
10.3791/57230
, ,
1Department of Mechanical Engineering,Shibaura Institute of Technology

Summary

Bir mikrosıvısal sahip kanalı deforme yanağında akış denetimi, parçacık işleme, kanal boyut özelleştirme ve diğer kurulmaksızın kullanımda iken sunuyor. Biz onların şekil değiştirmek izin veren bir dizi Pins yapılan yanağında ile bir mikrosıvısal kanal imalatı için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Mikrosıvısal bileşenleri karıştırma, ayrılık, parçacık yakalama veya tepkiler gibi farklı anahtar mikrosıvısal işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli şekiller olması gerekir. Sonra bile imalat Kanal şekli korurken deforms bir mikrosıvısal kanal yüksek kronolojik zamanmekansal reconfigurability sağlar. Bu reconfigurability varolan “reconfigurable” veya “entegre” mikrosıvısal sistemlerinde başarmak zor tür anahtar mikrosıvısal işlevleri gereklidir. Dikdörtgen iğne ucunun yanal hizalanmış bir dizi oluşan bir deforme yanak ile bir mikrosıvısal kanal imalatı için bir yöntem açıklanmaktadır. İğne kendi boyuna yönde aktüatör pimleri bitiş konumlarını ve böylece, discretized kanal yanağında şeklini değiştirir. PIN boşluklar istenmeyen kaçağı veya yapışma bitişik pimleri Menisküs güçleri tarafından neden olduğu için neden olabilir. PIN boşlukları kapatmak için hidrokarbon floropolimer süspansiyon tabanlı boşluğu dolgu elastomerik bir bariyer tarafından eşlik girmiştik. Bu reconfigurable mikrosıvısal aygıt güçlü geçici zaman in-kanal değişim akışı oluşturabilir veya herhangi bir bölgesinde kanalın akışını durdurabilir. Bile onların varlığı ya da davranış imalat sırasında bilinmeyen olan bu özellik, isteğe bağlı olarak, hücre, viskoz sıvı, gaz kabarcıkları ve sigara-sıvıların, taşıma kolaylaştıracaktır.

Introduction

Mikrosıvısal cihazlar – az miktarda sıvı ve onların akımları denetleyen, mikro ölçekli cihazlar – Biyomedikal yordamlar minyatür “çip” biçimine artan taşınabilirlik ve çoğu zaman, uygun maliyet ile sunuyoruz. Bir son bir daha gözden geçirme1‘ de açıklandığı gibi alanlarda ve olumlu özellikleri oluşan çeşitli mikrosıvısal bileşenleri karıştırma, ayrılık, parçacık yakalama veya tepkiler gibi temel ve anahtar sıvı işlevleri gerçekleştirmek için geliştirilmiştir.

Davranış birçok mikrosıvısal cihazların tasarım aşamasında belirlenir iken, birtakım mikrosıvısal cihazlar yapısı veya davranış sonrası imalat değişikliklerine izin ver. Burada “reconfigurability” Bu özellik için bakın. Reconfigurability mikrosıvısal sistemleri genellikle bir aygıt tasarlamak için gereken maliyet ve zamanı azaltır ve/veya zamanla mikrosıvısal düzeni veya işlevlerini özelleştirme sağlar.

Daha önce açıklanan reconfigurable mikrosıvısal aygıtları aşağıdaki üç kategoride toplanır. İlk olarak, akış hızı ve kullanım sırasında değiştirilecek yön deformasyon elastomerik kanal sağlar. Reconfigurability kazanmak için elastomerik kanalları pnömatik basınç kaynakları2, Braille aktüatörler3veya4mühürleme sıkıştırma gibi çeşitli kontrol edilebilir ve dış güçler tarafından deforme. Çok katmanlı sıvı devreleri, manyetik ile modüler kanalları arasında bağlantı yapan operatördür gibi ikinci, reconfigurable cihazları modüler tasarımları üzerinde itimat ve havacilik boru tabanlı5. Üçüncü, cihazın kendisi reconfigurable değil ama microdroplet ulaşım elektrot dizilerin (genellikle dijital havacilik anılacaktır)6,7 ve asılı damla tabanlı mikrosıvısal aygıtları8 etkinleştirmek istendiğinde akış veya sıvı rota değiştirme.

Yine de, bu kurulmaksızın birçoğu topolojik ve makroskopik düzeyde sınırlıdır. Örneğin, birçok entegre mikrosıvısal aygıtları akışını durdurmak veya önceden tanımlanmış bölgelerde mikro daraltarak akış yönünü değiştirmek. Ancak, pozisyon ve bölgeler daraltılmış sayısı reconfigurable değildir. Dijital havacilik akışkan yeteneklerini çeşitli olmasına rağmen mümkün akışı büyük ölçüde her damlacık hacimce sınırlı. Buna ek olarak, hücre hücre kültür medya böyle damlacıkları kültürlü zaman fazladan çaba buharlaşma ve gaz dağıtımı damlacıkları gelen önlemek ve osmolalite şok ve ani pH değişikliği önlemek için gereklidir.

Kanal özelliği düzeyi reconfigurability gerçekleştirmek için dinamik olarak onları kullanım9ne zaman yeniden yapılandırmak için makine elemanları bir dizi oluşan hareketli yanağında bir mikrosıvısal cihazla önerdi. Böylece her iki ucuna pimleri kenarındaki bir parçasını tanımlanan bir deforme kenarındaki oluşturmak için küçük dikdörtgen pimleri dizilmişti. Pimleri sürgülü taşıma izin duvardan deformasyon veya hücreleri, kabarcıklar ve kanal partikülleri desenlendirme izin. Ölü cilt en aza indirmek ve reconfigurability en üst düzeye çıkarmak için olmak en aza indirgemek bitişik iğne arasındaki mesafe vardı. Ancak, güçlü kılcal eylem üzerinde küçük hareket iç bağlama pinleri arasında boşluklar ve dışında microchannel PIN boşluk girme, medya buharlaşma, bakteriyel veya sitotoksik kirlenme ve sonunda hücre neden herhangi bir sıvı kaçağı neden olur. ölüm. Bu nedenle, döngüsel PIN eylemler ve uzun vadeli hücre kültür10dayanacak sızıntısı Alerjik discretized kenarındaki tipi reconfigurable mikrosıvısal kanalları geliştirdik.

Bu makalede, biz mikrosıvısal hücre kültür aygıtı hücre kültür alanında dereceli artışı takip yeniden discretized bir yanak ile oluşturmak için bir protokol sağlar. Ayrı kanal yanağında airtightness floresan Imaging’i kullanma mercek altına alındı. Hücre kültürü uyumluluk ve hücre desenlendirme yeteneği üstünde-küçük parça hücre kültürü kullanarak değerlendirilir.

Ne zaman uygun kanal tasarım önceden belirlenmiş değil ve isteğe bağlı olarak değiştirilmesi gerekir bu mikrosıvısal sistem uygundur. Örneğin, bu sistem çeşitli ham örnekleri veya bioproducts kabul etmek için veya hücre büyümesini veya akış veya yakalama etkin nematodlar veya beklenmedik bir şekilde davranan kanal, küçük nesneler için geçiş bağlı kanal genişliği ve akış hızını ayarlamak için kullanılan olabilir bu Henüz tasarım zamanda gebe değil.

Protocol

1. gravür Pins (Şekil 2A) Aseton daldırma tarafından dikdörtgen pimleri ısıtınız. Pimleri 4 mL % 10 nitrik asit çeker tarafından passivate, o zaman belgili tanımlık eriyik vasıl 65 ° C fırında 30 dk için ısı. İğne deiyonize su kalıntı asit kaldırmak ve bir kağıt havlu ile kurulayın 5 min için solüsyon içeren temizleyicide. Pim kalıp yayın aracı 2 h.Sonicate için 0.5 ml deiyonize su 5 min için iğne batırmak. Bir gravür çanak (Şekil 2C) imal. Çizmek veya iki paralel çizgiler ile 4 mm farkı bir cetvel kullanarak bir cam slayt üzerinde kazımak. Kimyasal dayanıklı ve düşük viskozite yapıştırıcı coverglasses kesilmiş bir yüzey iki dikdörtgen için geçerlidir. İki kesim coverglasses, 4 mm boşluk cam slaytta bond. Paralel çizgi bir kılavuz olarak kullanın. Silikon yapıştırıcı gravür çanak üzerinde iki satır dağıtmak ( Şekil 2C konumu ve kontur büyüklüğü için bakınız).Not: (STL modeli dosya tamamlayıcı bir malzeme olarak bulunur) 3D baskılı şablonu kolayca ve doğru bir şekilde çizgiler çizmek yardımcı olacaktır. Pimleri gravür çanak üzerinde koymak, böylece onların düz ucundaki 2 mm uzunluğundaki ipuçları yapışkanlı çizgi deseni daldırılır. Tekrar pimleri tamamen kaplı emin olmak için ve bir kontur çizmek için yapıştırıcı dağıtmak. 38 ° C’ye ısıtılmış bir oksijen fermenterler gravür çanak transfer Gecede yapıştırıcı tedavisi için bekleyin. 5.0 M hidroklorik asit yavaş yavaş bir cam şişe 0.2 ml 0,2 mL 0.5 M nitrik asit ekleyin.Dikkat: Çok aşındırıcı ve potansiyel olarak patlayıcı karışımı, Aqua regia olarak da bilinir. Asit geçirmez lastik eldiven ve koruyucu gözlük ve çok asitler ele alırken dikkatli olun. Asla çözüm saklamayın. Nitrik asit, onun saldırganlık azaltmak için mümkün olduğunca azaltmak. 65 ° C’ye ısıtılmış bir Pinar gravür çanak koymak Pim ele geçen bölgede 0.4 mL asit karışımı dökün. 10 dakika bekleyin ve asit bir ölçek için transfer. 5 mL 0, 8 M sodyum bikarbonat çözeltisi ile pim bölge kazınmış deiyonize suyla da dahil olmak üzere tüm kalan asit nötralize. Pimleri gravür çanak pimleri boyuna cımbızla çekerek çıkarın. İğne deiyonize su 5 min 5 min için aseton sonication ardından için solüsyon içeren temizleyicide. Adım 1.2 olduğu gibi bu pimlerden hiçbirinin kazınmış bölge passivate. Bir dürbün ağı Dükkanı mikroskop ile kazınmış pimleri genişliğini kontrol edin. Böylece kazınmış bölgesinin genişliği 0.2 ± 1.7 içinde açıklanan gravür süreyi ayarlamak 0,02 mm. Pimleri 5 ml % 70 etanol de içeren bir cam şişe aktarın. Laminer kukuIeta şişeyi getir. İğne şişe dışarı almak ve onları kuru izin. 2. rezervuar ve Pins bir alan ile silikon levha imalatı. Pimleri ve sabit bir duvardan bir alan için bir kalıp tipik tekniğinde işlemler tarafından imal. Kat degreased cam kaymak ile 1000 devir / dakikada bir spin coater kullanarak negatif epoksi fotorezist 1 mL. 15 dk. tekrar 95 ° C sıcak tabakta fotorezist bu adım bir kez kuru. Kat üçüncü tabakası ile kaplı fotorezist cam slayt üzerinde 2.000 devirde fotorezist aynı spin. Fotorezist 30 dk için 95 ° C ocağın üzerinde kuru. Fotorezist katman 450 mJ/cm2 365 nm ultraviyole ışık için gelen bir photoplotted film üzerinden bir UV spot ışık kaynağına maruz bırakmayın. Bir el spreyi kullanarak bir çözücü (2-metoksi-1-methylethyl asetat) püskürtülerek fotorezist 15 dk. geliştirme için 95 ° C ocağın üzerinde maruz fotorezist fırında ve azot gazı ile kuruttun. Cam slayt desenli fotorezist ile bir plastik tabak altındaki yer. Polydimethylsiloxane (PDMS) prepolymer 3 mm kalınlığında için kalıp üzerine dökün. -800 kPa 10 dk, bir vakum desiccator PDMS prepolymer debubble. 1 h. Demold için 65 ° c fırında PDMS prepolymer neşter kullanarak kısmen tedavi PDMS döşeme plağını kurut. Tam olarak 1 h için 120 ° c fırında PDMS tedavi. Meselenin ana noktaları kalıp aynı neşter ile PDMS levha üzerinden uzak düzensiz kenarları kırpın. Bir kesim, özellikle(bkz: şekil 1)ekleme yuvasının pinleri tanımlar yüzeyi mümkün olduğunca temiz ve kesin olun. 2 mm çapında delik giriş/çıkış için biyopsi yumruklar kullanarak PDMS levhanın ana kanal uçları sorgulamaktı. Benzer şekilde, 1 mm-dimeter delikleri hava havalandırma kanal ucunda sorgulamaktı. Şekil 1A kanal düzeni ve bu delikler konumunu için bkz. 3. cihazın yerinde boşluk dolgu ve bariyer imalatı Meclisi. Microchannel derleme imal. Bir 10 × 20 mm No 4 coverglass 10 dk 60 ° c ısıtılmış bir temizleme solüsyonu içinde bırakın. İki kez coverglasses deiyonize suyla durulayın ve 10 dk 120 ° C’de kuru. Plazma-bond PDMS levha bir coverglass için: PDMS levha (kanal özelliği tarafı yukarı) ve temizlenmiş 10 × 20 mm No 4 coverglass bir sputter coater Vakum odasında yerleştirin. 60 PA oluşturmak hava vakum plazma odasına aşağı pompalama başlar (20 mA) 30 s. Hemen odaya delik. Bond PDMS kanal özelliği yan coverglass için levha kenarlarına ile uyumlu. Bağlı katmanları 10 dk 65 ° C fırında yerleştirin. Bağlı katmanları steril bir kapsayıcı’ı kullanarak Laminer kukuIeta getir. Onları 30 dk için UV ışığıyla sterilize. Böylece kendi amaçları microchannel diğer yanak formu Laminer başlık, pimleri yuvaya takın. Bitişik iğne uzunluğu (bkz: şekil 1B) dikey iki ucu temasını engellemek için farklı olmalıdır. Dikey uçları arasındaki büyük boşluğu tercih edilir. Bir alan (N-1) x (PIN genişlik) yeri ne zaman iğne farklı PIN uzunlukları (L Şekil 2A) ile N türlü hazırlanır. Bir üs ( Şekil 2B) imal. Yapmak ya da bir bölümü dosyası tabanının okuyup (toolpaths içeren; ek malzeme olarak dahil) iki sayısal denetim (NC) dosya yapmak CAD/CAM yazılımı kullanarak. İlk ek NC dosyanın bir 4 mm çap son fabrikası ve 1 mm çapında değirmen sonunda ikinci kullanır. 3 mm kalınlığında açık Polimetilmetaakrilat (PMMA) kurulu bir CNC değirmen kelepçe. Bilgisayar NC (CNC) değirmen denetleyicisinde ilk NC dosyasını açın. 4 mm sonu değirmen CNC değirmen yükleyin ve PMMA kurulu sonunda değirmene dokunarak Bölümü’nü sıfır bulmak. Tahta kesmek için NC kodu çalıştırın.Not: Zaman zaman sonunda değirmen ipucu soğutma ve yonga kaldırma için sıkıştırılmış hava ile darbe. 3.2.3 ikinci NC dosya ve bir 1 mm sonu fabrikası kullanarak yineleyin. Deterjan ile işlenmiş parçalar Isıtınız ve bir kağıt havlu ile kurulayın. Parçalar % 70 etanol ile sprey ve laminer kukuIeta getir. Bir PIN boşluğu dolgu ve elastomerik bariyer imal:Not: Adımları 3.3.1 – 3.3.7 aseptik Laminer mahallede yapılmalıdır. Boşluk dolgu beyaz petrolatum ve politetrafloroetilen toz 2:1 oranında ağırlığa göre karıştırarak hazırlayın. Ultrasonik bir homogenizer kullanarak karışımı lunaparkçı. Boşluk dolgu bir dağıtıcı şırınga dökün. Lavabo pompası yerleştirin ve şırınga ucu doldurmak için itin. Bir iğne takın ve iğne ucu doldurulana kadar pistonu tekrar bas. Aynı şekilde, bir dalgıç ve bir iğne ile bir dağıtıcı şırınga hazırlamak ve silikon yapıştırıcı ile doldurun. Her şırınga bir pnömatik dağıtıcı bir bağdaştırıcı tüp kullanarak bağlayın. Silikon yapıştırıcı ve dolgu 250 kPa ve 280 kPa için besleme baskısı ayarlayın. Silikon yapıştırıcı bir cep tabanının kenarına dağıtmak. Bir 10 × 20 mm No.4 coverglass cebin yerleştirin ve sıkıca bağ için tuşuna basın. Silikon yapıştırıcı iki parçalar tabanında iki dış yarık çizmek için yaklaşık 1 mm derinliğe dağıtmak. Diğer yuvası parçalar çizmek için boşluk dolgu derinliğe kadar yaklaşık 1 mm, dağıtmak. Silikon yapıştırıcı başka bir cep kenarına dağıtmak. Cebin microchannel derleme (3.1) yerleştirin ve sıkıca bağ için tuşuna basın. 3.3.5 boşluğu dolgu ve silikon yapıştırıcı tamamen pimleri katıştırmak ve hiçbir açılış Yuvaları olduğunu emin olmak için yineleyin. Paslanmaz çelik kutusu kapaklı gibi steril bir kap içinde cihazı yerleştirdim. Oksijen fermenterler kapsayıcıya ısıtmalı transferi ile 38 ° c Laminer başlık, elastomerik bariyer için bir gün tedavi. Her pin 1 mm bitişik süzgeçte pimleri tedavi elastomerik bariyer üzerinden yayın için boyunca taşıyın. UV ışığıyla aygıt için 30 dk sterilize. 4. mikrosıvısal aygıt değerlendirilmesi Floresans kullanarak sızıntısı tespit İyi bir araç veya bir masaüstü robot kullanarak microchannel açın. Kanal genişliği olarak mümkün olduğunca kanal boyunca tutarlı olun. Yeşil flüoresan boya Floresans çözüm yapmak için 10 µM, deiyonize suyla seyreltik. Floresans çözüm microchannel bir micropipettor ile bitiş noktalarından birini ekleyin. Bu adımı kanal çözüm ile doldurur. Mikrosıvısal aygıt ve büyük bir plastik tabak deiyonize su ile ıslak emici kağıt iki adet koyun. Çanak 37 ° C ve % 5 CO2 en az 24 saat için kuluçkaya. Microchannel ters bir floresan mikroskobu ile görüntülerini yeşil floresan mikroskop fotoğraf makinesi ile kaydedin. Bir uygun görüntü analiz yazılımı ile floresan görüntüleri açın ve hiçbir sızıntı (yeşil floresan) boşluğu dolgu ve pimleri arayüzü olduğunu onaylayın. Microchannel tohum hücrelere. % 70-80 Konfluent hücreleri (bağlı olarak hücre tipleri) içeren bir hücre kültür gemi hazırlamak. Bağlantısını kesin ve büyüme orta hücrelerde askıya alma. Hücreler (hücre türleri üzerinde hız ve zaman bağlıdır) santrifüj kapasitesi ve orta Aspire edin. Orta az miktarda hücrelerle resuspend. Bir hücre sayaç içeren hücreleri saymak ve 1,5 × 106 hücre yoğunluğu 1,5 × 107 hücre/ml ayarlayın. Microchannel düz 400 µm genelinde kanal yapmak için iyi bir araç ya da masaüstü robot (şekil 1B) kullanarak açın. Duvardan mümkün olduğunca kanal boyunca düz olarak yapmak için PIN pozisyonları ayarlamak. Hücre süspansiyon microchannel bitiş noktasının birine ekleyin ve kanal doldurun. Yanak bölgesinin kültür başlatmak için tanımlar iğnelerden biri bulun. Ters bir mikroskop altında hücre hücre kültür bölgede içine iki bitişik iğneli kapatın. Kanaldan tüm hücreleri sınırdışı kaliteden iç dış tüm pins kapatın. Yavaşça süspansiyon bitiş noktalarını Aspire edin ve orta eklemelisiniz. Cihazın 4.1.4 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya. Ne zaman yaklaşık % 70-80 hücrelerdir Konfluent, yavaş yavaş kültür alanı genişletmek için bir PIN açın.

Representative Results

Reconfigurable microchannel inşaatı şekil 1′ de gösterilen. Birden fazla dikdörtgen pim cam alt katman üzerinde yerleştirildi ve böylece bu pimlerden hiçbirinin uzun kenar temas halinde dizilmiş. İle PDMS levha delik yumruk ve PIN yükseklik olarak aynı derinliği, bir ara Kanal giriş/çıkış rezervuarlar, kanal tavan ve iğne oluşuyordu kanal duvarın karşısında başka bir duvardan oluşturmak için iğne ucunun kaplı. İğne, bir duvar (PDMS sayfası yüzleri bir) ve cam alt katman tarafından çevrili bölge bir mikrosıvısal kanal oluştururlar. Daha önce açıklandığı gibi önerilen mikrosıvısal sistem reconfigurability birçok küçük iğneler çok küçük ama sıfır olmayan boşluklar ile paralel olarak yerleştirilen tarafından sağlanır. Önceki raporlarda sorun kılcal etkisiyle boşluklar oluşturulan güçlü akış oldu. Bu sorunu çözmek için boşlukları ilk boşluğu filler ile doluydu. Bu protokol için yapışkan hidrokarbon ve floropolimer toz dağılın karışımı bir boşluk dolgu kullanıldı. Ancak, boşluğu dolgu kendisi de tabi kapiller etkisidir. Bu nedenle, şekil 1′ de gösterildiği gibi elde edilen reconfigurable microchannel hidrokarbon/floropolimer boşluğu dolgu hem boşluğu filler dış çevresinde oluşan bir elastomerik bariyer vardır. Pimleri ortasına inceltme boşluğu dolgu kalınlığı sağlamak için yeterli miktarda ve iki iğneli arasında elastomerik bariyer gücünü karşılamak için gereklidir. Resim 2 A bir duvardan kesimi oluşturur bir PIN çizimi gösterir. Paslanmaz çelik sınıf 316L paslanmaz ve düşük özellikler leaching nedeniyle malzeme olarak seçildi. Ancak, bir ilave pasivasyon süreci iğneler hücre kültürü uyumlu hale getirmek için gerekli oldu. Bir PIN başarıyla kenarındaki kesimini oluşturmak üzere kenar pürüzleri olmadan tam olarak dikdörtgen bir ipucu olmalı. Buna ek olarak, bir PIN “kolu” olmalıdır böylece PIN kolayca kolu iterek hareket edebilir. Her PIN dar orta olduğundan, elastomer pinleri arasında kalınlığı PIN hareket tarafından neden kesme dayanmak için yeterliydi. Cihazın oluşan diğer parçalar, fabrikasyon dışında orta incelmesi, Pins, elektrik deşarj küçük işleme en hassas ve düşük maliyetli yöntemlerinden biridir çünkü (EDM) işleme konusunda uzmanlaşmış bir şirketten sipariş verilmesi parçalar sert metallerden yapılmış. Orta kendine oyma tarafından inceltme performans işleme maliyetini ve bükme veya işleme sırasında kırılma riskini azaltır. Boşluk dolgu, elastomerik bariyer ve sonunda reconfigurable microchannel watertightness düzgün onaylamak için sızıntı algılaması Floresans tarafından kullanıldı. Şekil 3 elastomerik bariyer kenarına yakın çevrenin bir floresan görüntü 3 gün sonra microchannel floresan izleyici boya içeren su ile dolu gösterir. Sıvı dolum elastomerik bariyer görünür kenarından yaklaşık 200 µm derinliğe kanal programları floresan görüntü. Ancak, sıvı boşluğu dolgu ulaşmadı. Ayrıca, boşluk dolgu elastomerik bariyer ile hiçbir sızıntı gözlendi. Bu gözlem sıkı uygun dar orta pimleri ve elastomerik bariyer arasında boşluklar sayesinde sıvı geçişini engelledi gösterir. Son olarak, yavaş yavaş şekil 4Agösterildiği gibi reconfigurable mikrosıvısal cihazın yan genişleterek adapte Kültür alanı ile uzun vadeli hücre kültürü yapılır. 0 d hücreleri az sayıda pin-genişlik ve diğer hücreleri Aspire birine eşit bir alan içinde sınırlı. 2 d, hücreler alt yüzeyine bağlanmıştır ve Proliferasyona başladı. Böylece confluency hala düşük olmasına rağmen tüm hücreleri açıkça görülebilir, iki iğneli çekildi. 5 d, hücrelerin prolifere devam etti ve confluency arttı. 6 ve 9 d, iki iğneli hücreleri underconfluent tutmak için geri çektiği. Şekil 4′ teBkademeli genişleme kültür çevrenin etkisi gösterilmiştir. Pin(s) çekildi günde hücre dansitesi ani değişiklikler vardı. Ancak, normal hücre kültüründe görülen üstel ise hücre sayısı büyüme hızının sabit tutuldu. Resim 1 : Reconfigurable mikrosıvısal bir PIN discretized kenarındaki aygıtla. (A) parçalar ve reconfigurable mikrosıvısal aygıt inşası. Cihaz ile bir duvardan PDMS/cam microchannel özellikleri eklenen 10 paslanmaz çelik pim ucunun oluşturduğu bir düz kanal vardır. Boşluk dolgu ve elastomerik bir bariyer engeller sıvı PIN boşluklar sızıntı. Coverglasses, boşluk dolgu ve elastomer bariyer bir Polimetilmetaakrilat için (PMMA) temel sabittir. (B) otomatik PIN manipülatör. Metal bir sacdan yapılmış bir bitiş efektör 3 eksenli masaüstü robot sabittir. Bir PIN taşımak için dikey sonuna sonu efektör iter. İğne farklı uzunlukları ile üç kez PIN genişliği bir aralıkta yerleştirilir. Aralığın bitiş efektör arkadaşları bir PIN bir kez yeterli izni ile emin olmayı sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Mekanik çizim protokolünde kullanılan işlenmiş parçaların. Milimetre birimlerdir; R bir RADIUS boyut gösterir; kare simgesi (□) kare özellikleri belirtir; t kalınlığı gösterir. (A) 316 L paslanmaz çelik PIN kenarındaki bir parçası olarak. Pins ve sipariş açıklandığı gibi işlenmiş. Bu işleme bir parçası olarak sipariş değil ama protokolünün parçası olarak yapılmadı çünkü köpek kemik gibi şekiller oluşturmak için PIN ortasına inceltme bu çizimde yansıtılmaz. (B) coverglasses, boşluk dolgu ve elastomerik bariyer PIN harekete karşı yerinde tutan Polimetilmetaakrilat (PMMA) Bankası. (C) orta Pins etch için kullanılan bir gravür yemek. Bir gravür yemek oluşturmak için dört adet cam silikon yapıştırıcı kullanarak bağlı bulunmaktadır. Bir kontur deseni silikon yapıştırıcı pimleri yerleşimini tarafından çizimde gösterildiği gibi yemeğin ardından çanak üzerinde çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Reconfigurable microchannel PIN boşluklar aracılığıyla gelen sızıntı tespiti Floresans. Yeşil flüoresan boya reconfigurable microchannel doldurma floresan görüntü bir boşluk dolgu (opak) oluşur seal yapısı faz kontrast görüntü üzerinde overlaid ve elastomerik bariyer (yarı saydam). Bir kenar elastomer bariyer Menisküs benzeri özellikleri görünür ve bir üst noktalı çizgiyle gösterilir; elastomer bariyer ve boşluk dolgu arasında arayüz siyah alan iletişim Menisküs benzeri özellikleri gösterilir ve daha düşük noktalı çizgiyle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : İlerici ve sürekli hücre büyümesini değişken hücre kültür alanında reconfigurable microchannel ile. (A) COS-7 hücre büyümesini yanağında taşıyarak sınırlı bir hücre kültür alanında. (B) büyüme eğrisi zaman evrim ve A gösterilen reconfigurable microchannel değişken boyutlu kültür bölgelerinde sınırlı COS-7 hücre yoğunluğu). Üç dikey ok sırasıyla 2, 5 ve 6 d, hücre kültürü alan genişleme göstermek. Hücre sayısı ek olarak, hücre yoğunluğu aynı kültür alanları tek tek her üstel büyüme eğrisi ile donatılmış ve karelerde gösterilen yerel katlama zaman (td [h]) tahmin etmek için kullanılan için gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

PIN discretized microchannel bir tam özellikli mikrosıvısal kanalıdır ve biz bu kanal şekli varolan herhangi bir mikrosıvısal kanalları ile karşılaştırıldığında açıkça yüksek reconfigurability olduğuna inanıyorum. Biz burada sağlanan iletişim kuralı yavaş yavaş kültürler confluency altında uzun süre tutmak için hücre kültürü yüzey alanı genişletilmesi ile hücre kültürünün edebilen bir mikrosıvısal aygıt sağlayacaktır. Aygıt-ecek da sağlamak in-kanal desenlendirme hücre proteinleri substrat önceden veya herhangi bir diğer dikkate zaman tasarım veya imalat biçimlenme olmadan. Buna ek olarak, bu reconfigurable mikrosıvısal aygıt kolayca bu akışı zor materyallerin aygıtları başa çıkabilirim çok az varolan mikrosıvısal işleme uygulamak yardımcı olacak güçlü Kanal içinde yer değiştirme akışı oluşturur. Bu hücreleri ve diğer mikroorganizmalar, gazlar ve diğer sıvıları arasındaki etkileşimi büyük değişiklik yapmadan bu aygıtın kullandığı aygıt tasarımında değerlendirilebilecek anlamına gelir.

Laplace basınç veya hidrostatik basınç kanal bir koya dış akış kontrol yöntemleri uygulama düşündünüz mü. Akış hava havalandırma kanalı aracılığıyla pimleri ve tavan/kat kanal arasındaki boşluklar oluşturur çünkü sıvı ölü sonunda iterek önermiyoruz. Birçok sıvı işlemleri bu PIN işlemler gerektirmez. Örneğin, karıştırma (tek bir PIN birkaç kez ileri geri hareketYani ) bir PIN tarafından sıvı ezme tarafından gerçekleştirilebilir.

En kritik cihaz pimleri parçalarıdır. Onlar bir microchannel oluşturması gerekir, ahenkli olmalı ve bitişik pim hareketi rehberlik gerekir hassas uzunluğu, parallelism en büyük ölçüde, düşeylik ve yüzey kalitesi pins için gereklidir. Bu nedenle, pimleri bir çizim Şekil 2içinAbenzer göndererek hassas işleme konusunda uzmanlaşmış bir şirketten sipariş verilmesi önerilir. Bu ek geometrik boyutlandırma gerektiren şirketler ve açık yüzey pürüzlülüğü yön olabilir. Ancak, eğer dikkatli ve zaman zaman nitrik asitle düzgünleştirilecek pimleri yeniden kullanılabilir.

Bir diğer önemli özelliği elastomerik engeldir ve oluşumu cihazın üretim süreçlerinde en kritik bir adımdır. Tam olarak işlenmiş bir üs tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için gerekli olacaktır. Pimleri iyileşmemiş bariyer yerleştirerek de kritik bir adımdır. Pimleri iyi hizalanmış ve katıştırılmış boşluk dolgu ve bariyer hava kabarcığı olmadan tutulmalıdır. Aşağıdaki adımları hangi mikrosıvısal cihazla yaygın bir sorundur iğneler aracılığıyla kaçağı önlemek.

Bu aygıt kullanarak diğer ortak bir) frictionally ölçülü pimleri ve b) hücre ölümü, konulardır ve düşük büyüme oranı. Olası neden için bu bir) düzensiz (konik veya dalgalı) gravür kazınmış yüzey ve boyutlu uyumsuz toplu iğne ucu yüksekliği ile silikon döşeme için bir kalıp fotorezist katmanda yüksekliğini arasındaki pin orta, zavallı kalite içerir. Uyum etchant formülasyonu, sıcaklık ve ajitasyon PIN hareket artırmanıza yardımcı olabilir. Buna ek olarak, balmumu veya yapışkan kullanmadan uygun deneme sorunu çözmek için ipuçları sağlar. Olası faktörler b) yetersiz pasivasyon pim, elastomerik bariyerler için yapıştırıcılar yelpazesi ve eksik yapıştırıcılar kür hatalar vardır. Bazı hücreler kaplama fibronektin veya diğer proteinler veya hücre adezyon teşvik polimerler microchannel içinde gerektirebilir. Buna ek olarak, optimizasyon trypsinization ve Santrifüjü gibi hücre kültür pratikte microchannel ölü hücreleri azalacak.

Sunulan imalat Protokolü sınırlamaları, yanağında bir tane discretized biridir. Her iki yanağında PIN dizileri tarafından yerleşik olan, kanal reconfigurability daha da artıracaktır. İki katına pimleri ve daha uzun üretim adımları gerektirir, ancak teknik olarak uygun bir seçenek budur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma KAKENHI (20800048, 23700543) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Oven Yonezawa MI-100
10% Nitric Acid Wako Chemicals 149-06845
Stainless steel pins Micro Giken N/A 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM
Mold release agent Fluoro Technology FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS) Shin-Etsu Chemicals KE-106
Negative epoxy photoresist Nippon Kayaku SU-8 3050
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 26 x 60mm No.4
Acetone Kanto Chemicals 01060-79
Glass slides (Large) Matsunami Glass 76 x 52mm No.1
Silicone adhesive Shin-Etsu Chemicals KE-41
White petrolatum Nikko Rica Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder Power House Accele Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-thick) Various N/A
Pneumatic dispenser Musashi Engineering ML-5000XII
Hydrochloric acid Kanto Chemicals 180768-00
Computer numerical control (CNC) mill Pro Spec Tools PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter) Mitsubishi Materials MS2MSD0100
Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) Cotronics Duralco 4460
Borisilicate glass vials Various To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass.
Sodium bicarbonate Kanto Chemicals 37116-00
Ultrasonic cleaner AS ONE AS12GTU
Ultrasonic drill Shinoda Tools SOM-121 Used as a ultrasonic homogenizer.
Spin coater Active ACT-220DII
Hotplate AS ONE ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi) Unno Giken N/A Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted.
2-methoxy-1-methylethyl acetate Wako Chemicals 130-10505
UV spot light source Hamamatsu L8327 Ultraviolet source
Nitrogen Various N/A
Vacuum desiccator and pump AS ONE MVD-100, GM-20S
Scalpels Various No.11
Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) Kai Medical BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glass engraving pen Various N/A
Cleaning solution Tama Chemicals TMSC Dilute 1:100 with deionized water
Sputter coater San-yu Electron SC-708 For plasma bonding.
Dispenser syringe (5 ml) Musashi Engineering PSY-5E
Plunger Musashi Engineering FLP-5E
Blunt needle (21G) Musashi Engineering PN-21G-B
Adapter tube Musashi Engineering AT-5E
Fermenter Japan Kneader PF100
Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) Thermo Fisher A33077
Large plastic dish Greiner bio-one 688161
Absorbent paper Asahi Kasei BEMCOT M-1
Inverted microscope Leica DMi8
Microscope camera Qimaging Retiga 2000R
Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) GE Health Care SH30021.01
Antibiotic-antimycotic solution Thermo Fisher 15240-062
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher 25200-056
Phosphate buffered saline (PBS) GE Health Care SH30256.01
Fetal bovine serum (FBS) Biowest S1820
Cell counter FPI OC-C-S02
Cell culture vessel VIOLAMO VTC-D100
15 ml conical tube Corning 352095
Shop microscope PEAK 2034-20
Hand sprayer FURUPLA No.3530
Coverglasses (Rectangular) Matsunami Glass 10 x 20mm No.4
CAD/CAM software Autodesk Inventor HSM
Nitrogen gas pressure regulator AS ONE GF1-2506-RN-V Set to 0.1 MPa
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
  2. Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
  3. Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -. C., Meiners, J. -. C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505 (2007).
  4. Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
  5. Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
  6. Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
  7. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
  8. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
  9. Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
  10. Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).

Tags

Reconfigurable Microfluidic DevicePin-discretized SidewallsMicrofluidic ChannelEtchingStainless Steel PinsNitric AcidMold Release AgentEtching DishEtching AcidSodium Bicarbonate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Futai, N., Fujita, K., Ikuta, W. Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls. J. Vis. Exp. (134), e57230, doi:10.3791/57230 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image