Reconfigurable canal microfluídico con flancos discretizar Pin

1. grabado de pernos (figura 2A) Desengrasar pins rectangulares por inmersión en acetona. Apaciguar las clavijas sumergiendo en 4 mL de ácido nítrico al 10%, entonces la solución a 65 ° C por 30 min en un horno de calor. Someter a ultrasonidos los pasadores en agua desionizada durante 5 min eliminar el ácido residual y seque con una toalla de papel. Sumerja las clavijas en 0,5 mL de agente desmoldante para h.Sonicate 2 pins en agua desionizada durante 5 minutos. Fabricar un plato grabado (figura 2C). Dibujar o inscribir dos líneas paralelas con una separación de 4 mm en un portaobjetos de vidrio utilizando una regla. Aplique un adhesivo resistente a productos químicos y de baja viscosidad a una superficie de dos rectangular corte coverglasses. Enlazar las dos coverglasses corte sobre el portaobjetos de cristal en un espacio de 4 mm. Guíese por la línea paralela. Dispensar dos líneas de adhesivo de silicona sobre el plato de la aguafuerte (ver figura 2C para la posición y el tamaño del contorno).Nota: Una plantilla impresa en 3D (un archivo de modelo STL está incluido como material suplementario) le ayudará a trazar líneas con precisión y fácilmente. Coloque los pernos en el plato grabado para que las 2 puntas mm de largo en sus extremos rectos están inmersos en el patrón de línea adhesiva. Dispense el adhesivo para asegurar que los pernos están completamente cubiertos y dibujar un contorno. Transferir el plato grabado a un fermentador humidificado calentado a 38 ° C. Esperar la noche para curar el adhesivo. Añadir 0,2 mL de ácido nítrico de 0,5 M a 0,2 mL de 5.0 M de ácido clorhídrico lentamente en un frasco de vidrio.PRECAUCIÓN: La mezcla, también conocido como agua regia, es muy corrosivo y potencialmente explosivos. Use guantes de goma a prueba de ácidos y gafas de seguridad y ejercer extrema precaución al manipular ácidos. Nunca guarde la solución. Reducir el ácido nítrico como sea posible para disminuir su agresividad. Poner el plato de grabado sobre una placa calentada a 65 ° C. Vierta 0,4 mL de la mezcla ácida sobre la región descubierta de los pernos. Espere 10 min y transferir el ácido en un vaso. Neutralizar todo el ácido restante incluyendo la región grabada de los pernos con 5 mL de solución de 0,8 M de bicarbonato de sodio en agua desionizada. Retire los pernos del plato grabado los pernos longitudinalmente con las pinzas. Someter a ultrasonidos los pasadores en agua desionizada durante 5 min seguido de sonicación en acetona por 5 minutos. Apaciguar la región grabado al agua fuerte las clavijas como en el paso 1.2. Compruebe el ancho de las clavijas de grabado al agua fuerte con un microscopio de la tienda con una retícula. Ajustar el tiempo de grabado descrito en 1.7 por lo que el ancho de la región al ácido es 0,2 ± 0,02 mm. Transferencia de los pernos a un frasco de vidrio que contiene 5 ml de etanol al 70%. Poner el frasco a una campana laminar. Levante los pasadores de la cubeta y déjelos secar. 2. fabricación de losa de silicona con embalses y un espacio para pernos. Fabricar un molde para un espacio para pernos y un flanco fijo por típicos procesos litográficos. Capa un portaobjetos de vidrio desengrasado con 1 mL de photoresist negativo epoxi usando a un recubridor spin a 1.000 rpm. Seque la fotoresistencia en una placa de 95 ° C durante 15 minutos repetir este paso una vez. La tercera capa de la misma photoresist a 2.000 rpm en el portaobjetos de cristal con fotoresistencia revestido de capa de la vuelta. Seque la fotoresistencia en una placa de 95 ° C durante 30 minutos. Exponga la capa de photoresist a 450 mJ/cm2 de luz ultravioleta de 365 nm de una fuente de luz spot UV a través de una película de photoplotted. Hornear el photoresist expuesto en una placa de 95 ° C durante 15 minutos desarrollar la fotoresistencia rociando un solvente (acetato de 2-metoxi-1-metil) utilizando un pulverizador de mano y secar con secador con gas nitrógeno. Coloque el portaobjetos de vidrio con fotoresistencia estampado en la parte inferior de un plato de plástico. Vierta el prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) sobre el molde en un espesor de 3 mm. Debubble el prepolímero PDMS en un desecador de vacío en kPa-800 durante 10 minutos. Curar el prepolímero PDMS en un horno a 65 ° C durante 1 h. Demold la losa parcialmente curada de PDMS con un bisturí. Curar completamente el PDMS en una estufa a 120° C durante 1 hora. A lo largo del patrón de pauta, recortar bordes irregulares lejos de la losa PDMS con el mismo bisturí. Hacer lo más preciso y limpiar un corte como sea posible, particularmente en la superficie que define la ranura(ver figura 1)para los pasadores. Perfora 2 agujeros de mm de diámetro para la entrada y salida en los extremos del canal principal de la losa PDMS con Punzones de biopsia. Del mismo modo, perforar agujeros de diámetro mm 1 en los extremos del canal de ventilación de aire. Ver figura 1A para el diseño de canales y la posición de estos agujeros. 3. montaje del dispositivo en el lugar de fabricación del solucionador de problemas y la barrera. Fabricar una Asamblea de microchannel. Sumerja un 10 × 20 mm Nº 4 cubreobjetos en una solución de limpieza calentado a 60 ° C durante 10 minutos. Enjuague dos veces el coverglasses con agua desionizada y secar a 120 ° C durante 10 minutos. Plasma-bond la losa PDMS un cubreobjetos: Colocar la losa PDMS (canal característica lado hacia arriba) y las limpieza 10 × 20 mm Nº 4 cubreobjetos en la cámara de vacío de un recubridor sputter. Inicio de bombeo a la cámara a 60 plasma aire vacío PA generar (20 mA) para 30 s. Inmediatamente la cámara de ventilación. Enlace al lado de la función de canal de los PDMS de la losa para el cubreobjetos con sus bordes alineados. Colocar las capas de servidumbre en un horno de 65 ° C durante 10 minutos. Poner las capas de servidumbre a una campana laminar utilizando un recipiente estéril. Esterilizarlas con luz ultravioleta durante 30 minutos. En la campana laminar, inserte los pernos en la ranura para que sus extremos formen el otro flanco de la MCP. Pernos adyacentes deben ser diferentes en longitud para evitar el contacto de ambos extremos verticales (ver figura 1B). Gran espacio entre los extremos verticales es preferible. Un espacio de (N-1) × (perno ancho) es posible cuando se prepararon N las clases de pernos con longitudes diferentes pin (L en la figura 2A). Fabricar una base ( figura 2B). O leer un archivo de parte de la base y dos archivos de control numérico (NC) (que contienen las trayectorias de herramienta, incluido como material suplementario) utilizando software CAD/CAM. El primer archivo suplementario de NC usa un molino de extremo de mm de diámetro y el segundo un 1 mm de diámetro extremo molino 4. Abrazadera de un tablero de 3 mm de espesor transparente polimetilmetacrilato (PMMA) en un molino CNC. Abra el primer archivo de NC en el controlador de un molino de NC (CNC) de la computadora. Instale una fresa de 4 mm en el molino CNC y localice la parte cero tocando el molino de extremo para el tablero de PMMA. Ejecute el código NC para cortar la tabla.Nota: Soplar de vez en cuando la punta del molino de extremo con aire comprimido para la eliminación de la refrigeración y chip. Repita 3.2.3 con el segundo archivo de NC y una fresa de 1 mm. Desengrasar las piezas trabajadas a máquina con detergente y seque con una toalla de papel. Rociar las piezas con etanol al 70% y llevarlos a una campana laminar. Fabricar una barrera elastomérico y solucionador de problemas de pin:Nota: Pasos 3.3.1 – 3.3.7 deben realizarse asépticamente en una campana laminar. Preparar el solucionador de problemas mediante la mezcla de petrolato blanco y polvo de politetrafluoroetileno en una proporción 2:1 en peso. Homogeneizar la mezcla utilizando un homogeneizador de ultrasonidos. Vierta el solucionador de problemas en una jeringa dispensador. Inserte un émbolo y empujarlo para llenar la punta de la jeringa. Conecte una aguja y empuje el émbolo otra vez hasta que se llene la punta de la aguja. Asimismo, preparar una jeringa dispensador con un émbolo y una aguja y rellenar con adhesivo de silicona. Conecte cada jeringa a un dosificador neumático usando un tubo del adaptador. Ajustar las presiones de descarga para pegamento de silicona y relleno de 280 kPa y 250 kPa. Dispense el adhesivo de silicona en el borde de un bolsillo de la base. Coloque un 10 × 20 mm No.4 cubreobjetos en el bolsillo y presione firmemente para enlazar. Dispense el adhesivo de silicona a una profundidad de aproximadamente 1 mm a dibujar dos segmentos a lo largo de dos ranuras externas de la base. Dispense el solucionador de problemas a una profundidad de aproximadamente 1 mm, para trazar los segmentos a lo largo de la ranura de la otra. Dispense el adhesivo de silicona en el borde del bolsillo de otro. Colocar un montaje de microchannel (3.1) en el bolsillo y presione firmemente para enlazar. Repita el 3.3.5 para asegurar que solucionador de problemas y adhesivo de silicona totalmente, incorporar las clavijas y que no hay ninguna apertura en las ranuras. Poner el dispositivo en un recipiente estéril como una caja de acero inoxidable con tapa. Trasladar el contenedor a un fermentador humidificado calentado a 38 ° C. En la campana laminar, curar la barrera elastomérica para un día. Mueva cada uno perno de hasta 1 mm a lo largo de pernos adyacentes para soltar los pernos de la barrera de elastómero curado. Esterilizar el dispositivo con la luz UV durante 30 minutos. 4. evaluación del dispositivo microfluídico Detectar fugas usando fluorescencia Abrir los microcanales utilizando una herramienta fina o un robot de escritorio. Hacer el ancho de canal como constante a lo largo del canal como sea posible. Diluir un colorante fluorescente verde con agua desionizada en 10 μm para hacer solución de fluorescencia. Añadir solución de fluorescencia a uno de los puertos de extremo de la MCP con una micropipeta. Este paso llenará el canal con la solución. Poner el dispositivo de microfluidos y dos pedazos de papel absorbente mojado con agua desionizada en un plato grande de plástico. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 24 h. Grabación de imágenes de fluorescencia verde de microchannel con un microscopio fluorescente invertido con una cámara de microscopio. Abra las imágenes fluorescentes con un software de análisis de imagen adecuada y confirmar que no es ninguna salida (fluorescencia verde) en el interfaz del solucionador de problemas y los pernos. Células de la semilla a la MCP. Preparar un vaso de cultivo celular que contiene células confluentes de 70-80% (dependiendo del tipo de célula). Soltar y suspender las células en un medio. Centrifugar las células (la velocidad y el tiempo dependen de los tipos de células) y aspirar el medio. Resuspender las células con una pequeña cantidad de medio. Contar las células con un contador celular y ajustar la densidad de la célula de 1.5 × 106 a 1,5 × 107 células/mL. Abrir los microcanales utilizando una herramienta fina o un robot de escritorio (figura 1B) para hacer un canal recto 400 μm de ancho. Ajuste el perno posiciones para hacer el flanco como plano a lo largo del canal como sea posible. Añadir la suspensión celular a uno de los puertos de extremo de la MCP y llenar el canal. Localice uno de los pasadores que define la pared lateral de la región para iniciar cultivo. Bajo un microscopio invertido, cerca de los dos pernos adyacentes para incluir las células en la región de la cultura de célula. Cerca de todos los pines de la orden de interior a exterior para expulsar a todas las células del canal. Suavemente Aspire suspensión desde los puertos de extremo y añadir medio a ellos. Incubar el dispositivo como se describe en 4.1.4. Cuando las células están alrededor del 70-80% confluente, abra lentamente un pin para ampliar el área de cultura.