Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri
Summary
Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
Mitokondri tarafından işleme Ca2 + hücreleri geniş bir yelpazede fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerinde düzenleyen bir kritik işlevdir. Yeteneği doğru akın ve sızma Ca2 + mitokondri üzerinden ölçmek için bu işlemlerde işleme mitokondrial Ca2 + rolünü belirlemek için önemlidir. Bu rapor halinde mitokondrial Ca2 + işleme izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için iki yöntem sunar. Biz ilk Ca2 + hassas boya kalsiyum yeşil-5N kullanarak mitokondrial Ca2 + alımı ölçmek için plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı. Plaka okuyucu tabanlı biçimi özel ekipman ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve kalsiyum yeşil-5N boya Ca2 + izole doku mitokondri üzerinden ölçmek için idealdir. Bizim uygulamamız için ölçüm mitokondrial Ca2 + Alım fare kalp dokusundan izole mitokondri içinde açıklar; Ancak, bu yordamı diğer doku karaciğer, kas iskelet ve beyin gibi gelen izole mitokondri mitokondrial Ca2 + anlamazdın ölçmek için uygulanır. İkinci olarak, biz bir confocal mikroskobu tabanlı tahlil mitokondrial Ca2 + Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM kullanarak ve 2 boyutlu lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleme permeabilized hücrelerdeki ölçüm için tanımlamak. Bu permeabilization Protokolü sitozolik boya kirlenme, mitokondrial Ca2 +değişikliklerin belirli kayıt için izin ortadan kaldırır. Ayrıca, lazer tarama mikroskobu yüksek kare hızları mitokondrial Ca2 + çeşitli ilaçlar veya dış çözümde uygulanan reaktifler yanıt olarak hızlı değişimlerin yakalamak için izin verir. Bu iletişim kuralı mitokondrial Ca2 + anlamazdın kardiyak miyositler ve nöronlar ve ölümsüzleştirdi hücre hatları gibi Primer hücre de dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ölçmek için uygulanır.
Introduction
Mitokondri intrasellüler Ca2 + depolama ve sinyal kritik siteler vardır. Onlarca yıllık araştırma mitokondri yeteneği alma ve Ca2 + 1,2çekilmek zorunda gösterdi. Mitokondri, ancak, Ca2 + depolama sadece pasif siteler değildir. CA2 + mitokondrial yuvası, metabolik çıkış düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel sinyal işlevleri gerçekleştirir ve olmuştur harekete geçirmek-in mitokondrial aracılı hücre ölüm yolları, daha önce3gözden. Metabolik regülasyon için Ca2 + üç matris lokalize dehydrogenases tricarboxylic asit döngüsü hem de solunum zinciri kompleksleri, mitokondrial enerji üretim4,5 artırmak için etkinliğini artırır . Mitokondrial Ca2 + aşırı yük ve mitokondrial Ca işleme2 + dysregulated ile Ca2 + Tetikleyicileri mitokondrial geçirgenliği geçiş (MPTP) açılış, mitokondriyal iç zar permeabilization için önde gelen gözenek, membran potansiyel kaybı, şişme, mitokondrial disfonksiyon rüptürü ve sonuçta, hücre ölüm6,7,8,9. Böylece, mitokondrial Ca2 + sinyal doğrudan hücresel yaşam ve ölüm yolları metabolik kontrol ve MPTP-ölüm eksen etkiler.
Son yıllarda, orada hızla mitokondrial Ca2 + dinamikleri nedeniyle çalışmanın ilgi genişleyen büyük kısmı mitokondrial Ca2 + uniporter karmaşık moleküler bileşenlerin tanımlaması için mitokondri iç bir baş tarz-in Ca2 + şey zar ışınlama mitokondrial matris 10,11,12alın. Bu yapısal ve düzenleyici alt birimleri uniporter, tanımlaması ileri genetik olarak mitokondriyal Ca2 + akını mitokondriyal işlev ve fonksiyon bozukluğu modüle için hedefleme olasılığı getirdi ve çalışma kolaylaştırdı uniporter karmaşık ve mitokondrial Ca2 + akını hastalığı13,14,15‘ e katkı. Nitekim, mitokondrial Ca2 + sinyal hastalıkları kalp hastalığı ateş ve kanser16,17,18kadar çeşitli bir dizi patolojiler de karıştığı olmuştur, 19,20.
Temel metabolizması ve hücre ölümüne içinde sinyal mitokondrial Ca2 + önemi göz önüne alındığında ve biyolojik sistemleri geniş ulaşmak ile kombine o mitokondrial Ca2 + sinyal etkiler, mitokondrial Ca2 + değerlendirmek için yöntemleri akın büyük ilgi vardır. Doğal olarak, çeşitli teknikler ve araçlar mitokondrial Ca2 + ölçmek için geliştirilmiştir. Bu alet öyle aynı derecede floresan Ca2 +kullanmak yöntemleri içerir-hassas boyalar21,22 ve mitokondri cameleon ve aequorin23, gibi hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörler 24. Bu makalede, farklı yöntemler ve mitokondrial Ca2 + alımı ölçülebilir sistemleri modellemek vurgulamak için hedeftir. Biz mitokondrial Ca2 + akını kapasitesini değerlendirmek için iki deneysel yöntem mevcut. Kardiyak mitokondri örnek olarak kullanarak, bir plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı mitokondrial Ca2 + ölçmek için Ca2 + hassas kullanarak alımı boya kalsiyum yeşil-5N izole doku mitokondri14 için idealdir . Kültürlü NIH 3T3 hücreleri kullanarak, Ayrıca görüntüleme tabanlı bir confocal mikroskobu tahlil mitokondrial Ca2 + permeabilized hücrelerdeki Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM25kullanarak ölçüm için açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mitokondrial Ca2 + akını ölçmek için iki farklı yaklaşımlar açıklayın. Plaka okuyucu tabanlı kalsiyum yeşil-5N yöntemi monitörler extramitochondrial Ca2 + düzeyleri ve izole mitokondri ölçümlerde için de uygun olan bir Ca2 + alımı tahlil olduğunu. Biz izole fare kardiyak mitokondri temsilcisi sonuçlar göstermiştir, bu tahlil dokulardan karaciğer, kas iskelet ve beyin de dahil olmak üzere yüksek mitokondrial bereket ile izole mitokondri için kolayca ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Amerikan Kalp Derneği (J.Q.K.) üzerinden hibe fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A. Calcium signaling in cardiac mitochondria. J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
