نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca2 + استيراد الفحص باستخدام Ca2 + حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca2 + صبغ Rhod-2/م.
Ca2 + التعامل مع الميتوكوندريا وظيفة هامة في تنظيم العمليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية سواء في مجموعة واسعة نطاق من الخلايا. القدرة على قياس التدفق وافلوكس من Ca2 + من الميتوكوندريا بدقة مهم لتحديد دور المتقدرية Ca2 + المناولة في هذه العمليات. وفي هذا التقرير، نقدم طريقتين لقياس المتقدرية Ca2 + المناولة في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. أولاً أننا تفاصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال على استخدام Ca2 + صبغة حساسة الكالسيوم الأخضر-5N. تنسيق المستندة إلى قارئ لوحة تلتف الحاجة إلى المعدات المتخصصة، وصبغ أخضر-5N الكالسيوم مثالي لقياس Ca2 + من الميتوكوندريا الأنسجة المعزولة. لطلبنا، يصف لنا قياس Ca2 + امتصاص المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القلب الماوس؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة أخرى مثل الكبد، والعضلات، والدماغ. وثانيا، يصف لنا تحليل القائم على الفحص المجهري [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد استخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/صباحا والتصوير المجهري ليزر المسح ثنائي الأبعاد باستخدام. يزيل هذا البروتوكول بيرميبيليزيشن صبغ سيتوسوليك التلوث، مما يسمح لتسجيل محددة من التغييرات في كاليفورنيا المتقدرية2 +. وعلاوة على ذلك، يسمح ليزر المسح المجهري للإطار معدلات عالية لالتقاط التغييرات السريعة في المتقدرية Ca2 + استجابة لمختلف العقاقير أو الكواشف المطبقة في الحل الخارجي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على قياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية مثل myocytes القلب والخلايا العصبية، وخطوط الخلية مخلدة.
الميتوكوندريا هي المواقع الحاسمة من Ca2 + مخزن داخل الخلايا والإشارات. عقود أبحاث أظهرت أن الميتوكوندريا لديها القدرة على الاستيراد، وتنحية Ca2 + 1،2. الميتوكوندريا، ومع ذلك، ليست المواقع مجرد السلبي من Ca2 + مخزن. Ca2 + في حجرة المتقدرية يؤدي وظائف الإشارات الأساسية بما في ذلك تنظيم المخرجات الأيضية وتفعيل مسارات الموت المتقدرية يتوسط الخلية، التي تم استعراضها سابقا3. للتنظيم الأيضي، Ca2 + يعزز نشاط ثلاثة dehydrogenases المترجمة بمصفوفة دورة حمض تريكاربوكسيليك، فضلا عن مجمعات سلسلة التنفس، لزيادة إنتاج الطاقة المتقدرية4،5 . مع المتقدرية Ca2 + التحميل الزائد و dysregulated المتقدرية Ca2 + المناولة، المسام Ca2 + مشغلات نفاذية المتقدرية الانتقال افتتاح (MPTP)، مما يؤدي إلى بيرميبيليزيشن المتقدرية الغشاء الداخلي، تمزق الأغشية الخسارة المحتملة، خلل mitochondrial، تورم، وفي نهاية المطاف، الخلية وفاة6،7،،من89. وهكذا، Ca2 + إشارات المتقدرية تؤثر تأثيراً مباشرا الحياة الخلوية ومسارات الموت عن طريق السيطرة الأيضية ومحور MPTP الموت.
في السنوات الأخيرة، هناك وقد تم التوسع بسرعة الاهتمام بدراسة المتقدرية Ca2 + ديناميات المستحقة في جزء كبير لتحديد مكونات جزيئية من Ca2 + أونيبورتير المتقدرية المعقدة، الداخلية المتقدرية استيراد غشاء الناقل الذي وضع الأولية من Ca2 + إلى11،،من 10مصفوفة المتقدرية12. تحديد هذه الوحدات الفرعية الهيكلية والتنظيمية أونيبورتير قد أوجد إمكانية استهداف وراثيا المتقدرية Ca2 + تدفق تعدل وظيفة الميتوكوندريا والخلل وتيسير الدراسة مساهمة من أونيبورتير المعقدة والمتقدريه Ca2 + التدفق للمرض13،،من1415. والواقع أن mitochondrial Ca2 + إشارات قد تورط في الأسباب المرضية لمجموعة متنوعة من الأمراض بدءاً من أمراض القلب نيوروديجينيريشن، وسرطان16،،من1718، ،من 1920.
نظراً لأهمية أساسية المتقدرية Ca2 + إشارات في الأيض وموت الخلايا، وجنبا إلى جنب مع نطاق واسع من النظم البيولوجية أن Ca2 + إشارات المتقدرية الآثار، أساليب تقييم المتقدرية Ca2 + تدفق ذات أهمية كبيرة. وليس من المستغرب، وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات وأدوات لقياس Ca المتقدرية2 + . وتشمل هذه الأساليب التي تستخدم أدوات مثل Ca نيون2 +-الأصباغ الحساسة21،22 المرمزة وراثيا Ca2 + وأجهزة الاستشعار والموجهة إلى الميتوكوندريا، مثل cameleon وأيكوورين23، 24. والهدف من هذه المقالة هو تسليط الضوء على مختلف أساليب ونظم النموذجي الذي يمكن أن يقاس Ca2 + امتصاص المتقدرية. نحن نقدم طريقتين تجريبية لتقييم المتقدرية Ca2 + تدفق القدرة. استخدام الميتوكوندريا القلب على سبيل مثال، نحن بالتفصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس Ca المتقدرية2 + صبغ الإقبال على استخدام Ca2 + حساسة الكالسيوم الأخضر-5N مثالي للأنسجة المعزولة الميتوكوندريا14 . باستخدام خلايا 3T3 المستزرعة في المعاهد الوطنية للصحة، يصف لنا أيضا تحليل القائم على تصوير مجهرية [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد باستخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/ص25.
وهنا يصف لنا نهجين مختلفين لقياس المتقدرية Ca2 + التدفق. لوحة الكالسيوم المستندة إلى القارئ الأخضر-5N أسلوب شاشات اكستراميتوتشوندريال Ca2 + المستويات وهو Ca2 + امتصاص مقايسة التي مناسبة تماما للقياسات في الميتوكوندريا المعزولة. وفي حين أننا قد أظهرت نتائج تمثيلية من الميتوكون…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل منح التمويل من جمعية القلب الأمريكية (J.Q.K.).
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
96 well plate | Corning | 3628 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E8145 | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
L-malic acid | Sigma | M1125 | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
Saponin | Sigma | S7900 | |
Ru360 | Calbiochem | 557440 |