Summary

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Published: April 27, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca2 + استيراد الفحص باستخدام Ca2 + حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca2 + صبغ Rhod-2/م.

Abstract

Ca2 + التعامل مع الميتوكوندريا وظيفة هامة في تنظيم العمليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية سواء في مجموعة واسعة نطاق من الخلايا. القدرة على قياس التدفق وافلوكس من Ca2 + من الميتوكوندريا بدقة مهم لتحديد دور المتقدرية Ca2 + المناولة في هذه العمليات. وفي هذا التقرير، نقدم طريقتين لقياس المتقدرية Ca2 + المناولة في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. أولاً أننا تفاصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال على استخدام Ca2 + صبغة حساسة الكالسيوم الأخضر-5N. تنسيق المستندة إلى قارئ لوحة تلتف الحاجة إلى المعدات المتخصصة، وصبغ أخضر-5N الكالسيوم مثالي لقياس Ca2 + من الميتوكوندريا الأنسجة المعزولة. لطلبنا، يصف لنا قياس Ca2 + امتصاص المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القلب الماوس؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة أخرى مثل الكبد، والعضلات، والدماغ. وثانيا، يصف لنا تحليل القائم على الفحص المجهري [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد استخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/صباحا والتصوير المجهري ليزر المسح ثنائي الأبعاد باستخدام. يزيل هذا البروتوكول بيرميبيليزيشن صبغ سيتوسوليك التلوث، مما يسمح لتسجيل محددة من التغييرات في كاليفورنيا المتقدرية2 +. وعلاوة على ذلك، يسمح ليزر المسح المجهري للإطار معدلات عالية لالتقاط التغييرات السريعة في المتقدرية Ca2 + استجابة لمختلف العقاقير أو الكواشف المطبقة في الحل الخارجي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على قياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية مثل myocytes القلب والخلايا العصبية، وخطوط الخلية مخلدة.

Introduction

الميتوكوندريا هي المواقع الحاسمة من Ca2 + مخزن داخل الخلايا والإشارات. عقود أبحاث أظهرت أن الميتوكوندريا لديها القدرة على الاستيراد، وتنحية Ca2 + 1،2. الميتوكوندريا، ومع ذلك، ليست المواقع مجرد السلبي من Ca2 + مخزن. Ca2 + في حجرة المتقدرية يؤدي وظائف الإشارات الأساسية بما في ذلك تنظيم المخرجات الأيضية وتفعيل مسارات الموت المتقدرية يتوسط الخلية، التي تم استعراضها سابقا3. للتنظيم الأيضي، Ca2 + يعزز نشاط ثلاثة dehydrogenases المترجمة بمصفوفة دورة حمض تريكاربوكسيليك، فضلا عن مجمعات سلسلة التنفس، لزيادة إنتاج الطاقة المتقدرية4،5 . مع المتقدرية Ca2 + التحميل الزائد و dysregulated المتقدرية Ca2 + المناولة، المسام Ca2 + مشغلات نفاذية المتقدرية الانتقال افتتاح (MPTP)، مما يؤدي إلى بيرميبيليزيشن المتقدرية الغشاء الداخلي، تمزق الأغشية الخسارة المحتملة، خلل mitochondrial، تورم، وفي نهاية المطاف، الخلية وفاة6،7،،من89. وهكذا، Ca2 + إشارات المتقدرية تؤثر تأثيراً مباشرا الحياة الخلوية ومسارات الموت عن طريق السيطرة الأيضية ومحور MPTP الموت.

في السنوات الأخيرة، هناك وقد تم التوسع بسرعة الاهتمام بدراسة المتقدرية Ca2 + ديناميات المستحقة في جزء كبير لتحديد مكونات جزيئية من Ca2 + أونيبورتير المتقدرية المعقدة، الداخلية المتقدرية استيراد غشاء الناقل الذي وضع الأولية من Ca2 + إلى11،،من 10مصفوفة المتقدرية12. تحديد هذه الوحدات الفرعية الهيكلية والتنظيمية أونيبورتير قد أوجد إمكانية استهداف وراثيا المتقدرية Ca2 + تدفق تعدل وظيفة الميتوكوندريا والخلل وتيسير الدراسة مساهمة من أونيبورتير المعقدة والمتقدريه Ca2 + التدفق للمرض13،،من1415. والواقع أن mitochondrial Ca2 + إشارات قد تورط في الأسباب المرضية لمجموعة متنوعة من الأمراض بدءاً من أمراض القلب نيوروديجينيريشن، وسرطان16،،من1718، ،من 1920.

نظراً لأهمية أساسية المتقدرية Ca2 + إشارات في الأيض وموت الخلايا، وجنبا إلى جنب مع نطاق واسع من النظم البيولوجية أن Ca2 + إشارات المتقدرية الآثار، أساليب تقييم المتقدرية Ca2 + تدفق ذات أهمية كبيرة. وليس من المستغرب، وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات وأدوات لقياس Ca المتقدرية2 + . وتشمل هذه الأساليب التي تستخدم أدوات مثل Ca نيون2 +-الأصباغ الحساسة21،22 المرمزة وراثيا Ca2 + وأجهزة الاستشعار والموجهة إلى الميتوكوندريا، مثل cameleon وأيكوورين23، 24. والهدف من هذه المقالة هو تسليط الضوء على مختلف أساليب ونظم النموذجي الذي يمكن أن يقاس Ca2 + امتصاص المتقدرية. نحن نقدم طريقتين تجريبية لتقييم المتقدرية Ca2 + تدفق القدرة. استخدام الميتوكوندريا القلب على سبيل مثال، نحن بالتفصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس Ca المتقدرية2 + صبغ الإقبال على استخدام Ca2 + حساسة الكالسيوم الأخضر-5N مثالي للأنسجة المعزولة الميتوكوندريا14 . باستخدام خلايا 3T3 المستزرعة في المعاهد الوطنية للصحة، يصف لنا أيضا تحليل القائم على تصوير مجهرية [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد باستخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/ص25.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة أموري. ملاحظة: الجزء الأول هو الإجراء التجريبي لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام قارئ لوحة. 1-الكواشف والحلول جعل 500 مل من…

Representative Results

ويبين الشكل 1 Ca المتقدرية2 + قياسات الامتصاص في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام منصة المستندة إلى قارئ لوحة و Ca2 + صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. تحت ظروف التحكم (الشكل 1A)، علقت في المخزن المؤقت بوكل المحتوية على الكالسيوم الأخضر-5N ?…

Discussion

وهنا يصف لنا نهجين مختلفين لقياس المتقدرية Ca2 + التدفق. لوحة الكالسيوم المستندة إلى القارئ الأخضر-5N أسلوب شاشات اكستراميتوتشوندريال Ca2 + المستويات وهو Ca2 + امتصاص مقايسة التي مناسبة تماما للقياسات في الميتوكوندريا المعزولة. وفي حين أننا قد أظهرت نتائج تمثيلية من الميتوكون…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل منح التمويل من جمعية القلب الأمريكية (J.Q.K.).

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope Olympus FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors Biotek
Tissue Homogenizer Kimble 886000-0022
22 x 22 mm coverslips Corning 2850-22
96 well plate Corning 3628
6 well plate Corning 3506
Calcium Green-5N Invitrogen C3737
MitoTracker green FM Invitrogen M7514
Rhod-2, AM Invitrogen R1244
DMSO Invitrogen D12345
Pluronic F-127 Invitrogen P3000MP
D-Mannitol Sigma M9546
Sucrose EMD Millipore 8510
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E8145
Potassium chloride Fisher BP366-500
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Magnesium chloride Sigma M2670
Sodium pyruvate Sigma P2256
L-malic acid Sigma M1125
Calcium chloride Sigma C4901
Potassium acetate Fisher BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Phosphocreatine disodium salt Sigma P7936
Saponin Sigma S7900
Ru360 Calbiochem 557440

References

  1. Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
  2. Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
  3. Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
  4. Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
  5. Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
  6. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
  7. Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
  8. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
  9. Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
  10. De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
  11. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
  12. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  13. Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
  14. Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
  15. Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
  16. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
  17. Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
  18. Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
  19. Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
  20. Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
  21. Dedkova, E. N., Blatter, L. A. Calcium signaling in cardiac mitochondria. J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).
  22. Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
  23. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
  24. Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
  25. Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
  26. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
  27. Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
  28. Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
  29. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  30. Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).

Play Video

Cite This Article
Maxwell, J. T., Tsai, C., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells. J. Vis. Exp. (134), e57225, doi:10.3791/57225 (2018).

View Video