Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

As mitocôndrias são sites críticos de Ca^{2 +} armazenamento intracelular e sinalização. Décadas de pesquisa demonstraram que as mitocôndrias têm a capacidade de importar e sequestro de Ca^{2 + 1,2}. Mitocôndrias, no entanto, não são meramente passivas sites de armazenamento de Ca^{2 +} . CA^{2 +} no compartimento mitocondrial executa funções de sinalização fundamentais, incluindo o Regulamento da produção metabólica e ativação das vias de morte celular mediada por mitocondrial, que tem sido revisado anteriormente³. Para a regulação metabólica, Ca^{2 +} aumenta a atividade de três matriz-localizada desidrogenases do ciclo do ácido cítrico, bem como complexos da cadeia respiratória, para aumentar a produção de energia mitocondrial^4,5 . Com a sobrecarga de Ca^{2 +} mitocondrial e desregulação mitocondrial Ca^{2 +} manipulação, Ca^{2 +} disparadores transição de permeabilidade mitocondrial pore abertura (MPTP), levando a permeabilização da membrana mitocondrial interna, perda potencial de membrana, disfunção mitocondrial, inchaço, ruptura e, finalmente, da pilha morte^6,7,8,9. Assim, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta diretamente a vida celular e vias de morte através do controle metabólico e eixo MPTP-morte.

Nos últimos anos, lá tem sido rápida expansão interesse no estudo da mitocondrial Ca^{2 +} dinâmica devido, em grande parte para a identificação dos componentes moleculares do Ca^{2 +} uniporter mitocondrial complexa, um interior mitocondrial transportador de membrana que é um modo primário de Ca^{2 +} importar para a matriz mitocondrial ^10,11,12. Identificação destas subunidades estruturais e reguladoras do uniporter tem trazido a possibilidade de direcionamento geneticamente mitocondrial Ca^{2 +} influxo para modular a função mitocondrial e disfunção e facilitou o estudo do contribuição do uniporter complexo e mitocondrial Ca^{2 +} influxo a doença^13,14,15. Com efeito, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial tem sido implicada nas patologias de um diversificado leque de doenças que variam de doença cardíaca a neurodegeneração e câncer^{16,17,18, 19,20}.

Dada a importância fundamental da mitocondrial Ca^{2 +} sinalização no metabolismo e morte celular e combinado com o amplo alcance dos sistemas biológicos que Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta, métodos para avaliar mitocondrial Ca^{2 +} influxo são de grande interesse. Não surpreendentemente, desenvolveram-se uma variedade de técnicas e ferramentas para medir mitocondrial Ca^{2 +} . Estes incluem métodos que utilizam ferramentas como fluorescente Ca^{2 +}-corantes sensíveis^21,22 e geneticamente codificado Ca^{2 +} sensores direcionados para a mitocôndria, como cameleon e aequorin^{23, 24}. O objetivo deste artigo é destacar os diferentes métodos e sistemas de modelo no qual mitocondrial Ca^{2 +} absorção pode ser medida. Apresentamos dois métodos experimentais para avaliar a capacidade mitocondrial Ca^{2 +} influxo. Usando a mitocôndria cardíaca como um exemplo, detalhamos uma plataforma baseada em leitor de placa de medição mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando o Ca^{2 +} sensível tintura verde-5N de cálcio que é ideal para mitocôndrias isoladas de tecido¹⁴ . Também utilizando culturas de células de NIH 3T3, descrevemos um ensaio baseado em imagem de microscopia confocal para medida de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas permeabilized usando o Ca^{2 +} sensível corante Rhod-2h²⁵.