Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.
CA2 + verwerking door mitochondriën is een kritische functie regulering van de zowel de fysiologische en pathofysiologische processen in een breed spectrum van cellen. De mogelijkheid om de toestroom en efflux van Ca2 + uit mitochondriën nauwkeurig te meten is belangrijk voor het bepalen van de rol van mitochondriale Ca2 + behandeling in deze processen. In dit rapport presenteren we twee methoden voor het meten van mitochondriale Ca2 + behandeling in zowel geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. We detail eerst een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. De plaat lezer gebaseerde indeling omzeilt de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur, en de calcium groen-5N kleurstof is bij uitstek geschikt voor het meten van Ca2 + uit geïsoleerde weefsel mitochondriën. Voor onze toepassing beschrijven we de meting van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van muis hartweefsel; deze procedure kan echter worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van andere weefsels zoals lever, skeletspieren en de hersenen. Ten tweede, beschrijven we een confocal microscopie gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM en beeldvorming met behulp van 2-dimensionale laser-scanning microscopie. Dit protocol permeabilization elimineert cytosolische kleurstof besmetting, rekening houdend met de specifieke opname van wijzigingen in mitochondriale Ca2 +. Bovendien voorziet laser scanning microscopie in hoge framesnelheid te vangen van snelle veranderingen in de mitochondriale Ca2 + in reactie op de verschillende drugs of reagentia toegepast in de externe oplossing. Dit protocol kan worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in veel celtypen, met inbegrip van primaire cellen zoals cardiale myocytes neuronen en vereeuwigd cellijnen.
Mitochondriën zijn kritieke sites van intracellulaire Ca2 + opslag en signalering. Decennia van onderzoek hebben aangetoond dat mitochondriën hebben de mogelijkheid om te importeren en sekwestreren Ca2 + 1,2. Mitochondriën, zijn echter niet louter passieve sites van Ca2 + opslag. CA2 + bij de mitochondriale compartiment functies fundamentele signalering met inbegrip van de verordening van metabole output en activering van mitochondriale-gemedieerde cel dood trajecten, die al herzien eerder3. Voor de verordening van het metabole verbetert Ca2 + de activiteit van drie matrix-gelokaliseerde dehydrogenases van de tricarboxylic acid cyclus evenals respiratoire ketencomplexen, te verhogen van mitochondriale energie productie4,5 . Met mitochondriale Ca2 + overbelasting en dysregulated mitochondriale Ca2 + handling, Ca2 + triggers mitochondriale permeabiliteit overgang porie (MPTP) openen, wat leidt tot mitochondriale binnenste membraan-permeabilization, membraan potentiële verlies, mitochondriale dysfunctie, zwelling, scheuren en uiteindelijk, cel dood6,7,8,9. Dus, mitochondriale Ca2 + signalering direct invloed zowel cellulaire leven en dood paden door metabole controle- en MPTP-dood as.
In de afgelopen jaren, er heeft zijn snel groeiende belangstelling voor de studie van mitochondriale Ca2 + dynamiek gepast in groot deel aan de identificatie van de moleculaire bestanddelen van de mitochondriale Ca2 + uniporter complex, een mitochondriale inner membraan-vervoerder die is een primaire modus van Ca2 + importeren in de mitochondriale matrix 10,11,12. Identificatie van deze structureel en regelgevend subeenheden van de uniporter heeft de mogelijkheid van genetisch targeting mitochondriale Ca2 + toestroom te moduleren mitochondriale functie en dysfunctie voortgebracht en vergemakkelijkt de studie van de bijdrage van de uniporter complexe en mitochondriale Ca2 + toestroom aan ziekte13,14,15. Inderdaad, de mitochondriale Ca2 + signalering heeft zijn betrokken bij de pathologieën van een divers scala aan ziekten, variërend van cardiale ziekte neurodegeneratie, en kanker16,17,18, 19,20.
Gezien het fundamentele belang van mitochondriale Ca2 + signalering in metabolisme en dood van de cel, en gecombineerd met het brede bereik van biologische systemen dat mitochondriale Ca2 + signalering gevolgen, methoden voor het beoordelen van de mitochondriale Ca2 + instroom zijn van groot belang. Niet verrassend, een verscheidenheid aan technieken en hulpmiddelen voor het meten van mitochondriale Ca2 + zijn ontwikkeld. Deze omvatten methoden die gebruik maken van hulpmiddelen zoals fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstoffen21,22 engenetisch-gecodeerde Ca 2 + sensoren gericht op de mitochondriën, zoals cameleon en aequorin23, 24. Het doel van dit artikel is om te markeren van de verschillende methoden en modelsystemen waarin mitochondriale Ca2 + opname kan worden gemeten. Presenteren we twee experimentele methoden voor de beoordeling van de mitochondriale Ca2 + toestroom capaciteit. Cardiale mitochondriën als een voorbeeld gebruikt, we detail een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N die ideaal geschikt is voor geïsoleerde weefsel mitochondria14 . Met behulp van gekweekte NIH 3T3 cellen, beschrijven we ook een confocale microscopie imaging gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM25.
Hier beschrijven we twee verschillende benaderingen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom. De plaat lezer gebaseerde calcium groen-5N methode monitoren extramitochondrial Ca2 + niveaus en is een Ca2 + opname test die is uitermate geschikt voor metingen in geïsoleerde mitochondriën. Terwijl wij representatieve resultaten uit geïsoleerde lymfkliertest cardiale mitochondriën hebben aangetoond, is deze test kunnen gemakkelijk aangepast voor mitochondria geïsoleerd uit weefsel…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de subsidiefinanciering uit de American Heart Association (J.Q.K.).
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
96 well plate | Corning | 3628 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E8145 | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
L-malic acid | Sigma | M1125 | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
Saponin | Sigma | S7900 | |
Ru360 | Calbiochem | 557440 |