Summary

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Published: April 27, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Abstract

CA2 + verwerking door mitochondriën is een kritische functie regulering van de zowel de fysiologische en pathofysiologische processen in een breed spectrum van cellen. De mogelijkheid om de toestroom en efflux van Ca2 + uit mitochondriën nauwkeurig te meten is belangrijk voor het bepalen van de rol van mitochondriale Ca2 + behandeling in deze processen. In dit rapport presenteren we twee methoden voor het meten van mitochondriale Ca2 + behandeling in zowel geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. We detail eerst een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. De plaat lezer gebaseerde indeling omzeilt de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur, en de calcium groen-5N kleurstof is bij uitstek geschikt voor het meten van Ca2 + uit geïsoleerde weefsel mitochondriën. Voor onze toepassing beschrijven we de meting van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van muis hartweefsel; deze procedure kan echter worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van andere weefsels zoals lever, skeletspieren en de hersenen. Ten tweede, beschrijven we een confocal microscopie gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM en beeldvorming met behulp van 2-dimensionale laser-scanning microscopie. Dit protocol permeabilization elimineert cytosolische kleurstof besmetting, rekening houdend met de specifieke opname van wijzigingen in mitochondriale Ca2 +. Bovendien voorziet laser scanning microscopie in hoge framesnelheid te vangen van snelle veranderingen in de mitochondriale Ca2 + in reactie op de verschillende drugs of reagentia toegepast in de externe oplossing. Dit protocol kan worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in veel celtypen, met inbegrip van primaire cellen zoals cardiale myocytes neuronen en vereeuwigd cellijnen.

Introduction

Mitochondriën zijn kritieke sites van intracellulaire Ca2 + opslag en signalering. Decennia van onderzoek hebben aangetoond dat mitochondriën hebben de mogelijkheid om te importeren en sekwestreren Ca2 + 1,2. Mitochondriën, zijn echter niet louter passieve sites van Ca2 + opslag. CA2 + bij de mitochondriale compartiment functies fundamentele signalering met inbegrip van de verordening van metabole output en activering van mitochondriale-gemedieerde cel dood trajecten, die al herzien eerder3. Voor de verordening van het metabole verbetert Ca2 + de activiteit van drie matrix-gelokaliseerde dehydrogenases van de tricarboxylic acid cyclus evenals respiratoire ketencomplexen, te verhogen van mitochondriale energie productie4,5 . Met mitochondriale Ca2 + overbelasting en dysregulated mitochondriale Ca2 + handling, Ca2 + triggers mitochondriale permeabiliteit overgang porie (MPTP) openen, wat leidt tot mitochondriale binnenste membraan-permeabilization, membraan potentiële verlies, mitochondriale dysfunctie, zwelling, scheuren en uiteindelijk, cel dood6,7,8,9. Dus, mitochondriale Ca2 + signalering direct invloed zowel cellulaire leven en dood paden door metabole controle- en MPTP-dood as.

In de afgelopen jaren, er heeft zijn snel groeiende belangstelling voor de studie van mitochondriale Ca2 + dynamiek gepast in groot deel aan de identificatie van de moleculaire bestanddelen van de mitochondriale Ca2 + uniporter complex, een mitochondriale inner membraan-vervoerder die is een primaire modus van Ca2 + importeren in de mitochondriale matrix 10,11,12. Identificatie van deze structureel en regelgevend subeenheden van de uniporter heeft de mogelijkheid van genetisch targeting mitochondriale Ca2 + toestroom te moduleren mitochondriale functie en dysfunctie voortgebracht en vergemakkelijkt de studie van de bijdrage van de uniporter complexe en mitochondriale Ca2 + toestroom aan ziekte13,14,15. Inderdaad, de mitochondriale Ca2 + signalering heeft zijn betrokken bij de pathologieën van een divers scala aan ziekten, variërend van cardiale ziekte neurodegeneratie, en kanker16,17,18, 19,20.

Gezien het fundamentele belang van mitochondriale Ca2 + signalering in metabolisme en dood van de cel, en gecombineerd met het brede bereik van biologische systemen dat mitochondriale Ca2 + signalering gevolgen, methoden voor het beoordelen van de mitochondriale Ca2 + instroom zijn van groot belang. Niet verrassend, een verscheidenheid aan technieken en hulpmiddelen voor het meten van mitochondriale Ca2 + zijn ontwikkeld. Deze omvatten methoden die gebruik maken van hulpmiddelen zoals fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstoffen21,22 engenetisch-gecodeerde Ca 2 + sensoren gericht op de mitochondriën, zoals cameleon en aequorin23, 24. Het doel van dit artikel is om te markeren van de verschillende methoden en modelsystemen waarin mitochondriale Ca2 + opname kan worden gemeten. Presenteren we twee experimentele methoden voor de beoordeling van de mitochondriale Ca2 + toestroom capaciteit. Cardiale mitochondriën als een voorbeeld gebruikt, we detail een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N die ideaal geschikt is voor geïsoleerde weefsel mitochondria14 . Met behulp van gekweekte NIH 3T3 cellen, beschrijven we ook een confocale microscopie imaging gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM25.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Emory University. Opmerking: Het eerste deel is de experimentele procedure voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van een afleesapparaat. 1. reagentia en oplossingen Breng 500 mL MS-EGTA buffer voor mitochondriale isolatie: 225 mM mannitol, sacharose 75 mM, 5 …

Representative Results

Figuur 1 toont mitochondriale Ca2 + opname metingen in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van de plaat lezer gebaseerde platform en de Ca2 + kleurstof calcium groen-5N. Onder controlevoorwaarden (figuur 1A), cardiale mitochondriën werden opgeschort in KCl buffer met calcium groen-5N en vervolgens uitgedaagd met opeenvolgende pulsen van CaCl2 (5 μl van een 0.6 mM CaCl2 opl…

Discussion

Hier beschrijven we twee verschillende benaderingen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom. De plaat lezer gebaseerde calcium groen-5N methode monitoren extramitochondrial Ca2 + niveaus en is een Ca2 + opname test die is uitermate geschikt voor metingen in geïsoleerde mitochondriën. Terwijl wij representatieve resultaten uit geïsoleerde lymfkliertest cardiale mitochondriën hebben aangetoond, is deze test kunnen gemakkelijk aangepast voor mitochondria geïsoleerd uit weefsel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de subsidiefinanciering uit de American Heart Association (J.Q.K.).

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope Olympus FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors Biotek
Tissue Homogenizer Kimble 886000-0022
22 x 22 mm coverslips Corning 2850-22
96 well plate Corning 3628
6 well plate Corning 3506
Calcium Green-5N Invitrogen C3737
MitoTracker green FM Invitrogen M7514
Rhod-2, AM Invitrogen R1244
DMSO Invitrogen D12345
Pluronic F-127 Invitrogen P3000MP
D-Mannitol Sigma M9546
Sucrose EMD Millipore 8510
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E8145
Potassium chloride Fisher BP366-500
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Magnesium chloride Sigma M2670
Sodium pyruvate Sigma P2256
L-malic acid Sigma M1125
Calcium chloride Sigma C4901
Potassium acetate Fisher BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Phosphocreatine disodium salt Sigma P7936
Saponin Sigma S7900
Ru360 Calbiochem 557440

References

  1. Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
  2. Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
  3. Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
  4. Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
  5. Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
  6. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
  7. Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
  8. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
  9. Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
  10. De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
  11. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
  12. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  13. Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
  14. Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
  15. Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
  16. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
  17. Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
  18. Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
  19. Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
  20. Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
  21. Dedkova, E. N., Blatter, L. A. Calcium signaling in cardiac mitochondria. J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).
  22. Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
  23. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
  24. Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
  25. Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
  26. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
  27. Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
  28. Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
  29. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  30. Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).

Play Video

Cite This Article
Maxwell, J. T., Tsai, C., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells. J. Vis. Exp. (134), e57225, doi:10.3791/57225 (2018).

View Video