Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca2 + импорта с помощью Ca2 + чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca2 + краситель кондицио-2/AM.
CA2 + обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca2 + от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca2 + обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca2 + обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с использованием Ca2 + чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca2 + от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клеток с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca2 +. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca2 + в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.
Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca2 + хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca2 + 1,2. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca2 + хранения. CA2 + в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее3. Для регуляции метаболизма Ca2 + усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства4,5 . С митохондриальных Ca2 + перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca2 + обработка Ca2 + триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca2 + сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.
В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca2 + в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca2 + Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca2 + импорт в митохондриальной матрицы 10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca2 + приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca2 + притока к болезни13,14,15. Действительно митохондриальных Ca2 + сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на16,,1718, 19,20.
Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca2 + сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca2 + сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca2 + приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca2 + . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca2 +-чувствительных красители21,22 и генетически закодированный Ca2 + датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин23, 24. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca2 + поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca2 + приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с помощью Ca2 + чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий14 . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клетки, с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM25.
Здесь мы опишем два различных подхода для измерения митохондриальной Ca2 + приток. Плиты на основе чтения кальция Грин 5N метод мониторов extramitochondrial Ca2 + уровнях и Ca2 + поглощение assay который хорошо подходит для измерений в изолированных митохондриях. В то время как мы показ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантовое финансирование от Американской ассоциации сердца (J.Q.K.).
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
96 well plate | Corning | 3628 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E8145 | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
L-malic acid | Sigma | M1125 | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
Saponin | Sigma | S7900 | |
Ru360 | Calbiochem | 557440 |