Summary

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Published: April 27, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca2 + импорта с помощью Ca2 + чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca2 + краситель кондицио-2/AM.

Abstract

CA2 + обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca2 + от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca2 + обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca2 + обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с использованием Ca2 + чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca2 + от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клеток с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca2 +. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca2 + в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.

Introduction

Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca2 + хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca2 + 1,2. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca2 + хранения. CA2 + в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее3. Для регуляции метаболизма Ca2 + усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства4,5 . С митохондриальных Ca2 + перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca2 + обработка Ca2 + триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca2 + сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.

В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca2 + в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca2 + Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca2 + импорт в митохондриальной матрицы 10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca2 + приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca2 + притока к болезни13,14,15. Действительно митохондриальных Ca2 + сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на16,,1718, 19,20.

Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca2 + сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca2 + сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca2 + приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca2 + . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca2 +-чувствительных красители21,22 и генетически закодированный Ca2 + датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин23, 24. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca2 + поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca2 + приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с помощью Ca2 + чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий14 . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клетки, с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM25.

Protocol

Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены институциональный уход животных и использование комитета университета Эмори. Примечание: Первая часть является экспериментальная процедура измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных сердечно?…

Representative Results

Рисунок 1 показывает митохондриальной Ca2 + измерения поглощения в изолированные сердца митохондрий, используя платформу на основе чтения пластины и Ca2 + краситель кальция Грин 5N. В условиях управления (рис. 1а), сердечной митох…

Discussion

Здесь мы опишем два различных подхода для измерения митохондриальной Ca2 + приток. Плиты на основе чтения кальция Грин 5N метод мониторов extramitochondrial Ca2 + уровнях и Ca2 + поглощение assay который хорошо подходит для измерений в изолированных митохондриях. В то время как мы показ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантовое финансирование от Американской ассоциации сердца (J.Q.K.).

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope Olympus FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors Biotek
Tissue Homogenizer Kimble 886000-0022
22 x 22 mm coverslips Corning 2850-22
96 well plate Corning 3628
6 well plate Corning 3506
Calcium Green-5N Invitrogen C3737
MitoTracker green FM Invitrogen M7514
Rhod-2, AM Invitrogen R1244
DMSO Invitrogen D12345
Pluronic F-127 Invitrogen P3000MP
D-Mannitol Sigma M9546
Sucrose EMD Millipore 8510
HEPES Sigma H3375
EGTA Sigma E8145
Potassium chloride Fisher BP366-500
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Magnesium chloride Sigma M2670
Sodium pyruvate Sigma P2256
L-malic acid Sigma M1125
Calcium chloride Sigma C4901
Potassium acetate Fisher BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Phosphocreatine disodium salt Sigma P7936
Saponin Sigma S7900
Ru360 Calbiochem 557440

References

  1. Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
  2. Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
  3. Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
  4. Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
  5. Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
  6. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
  7. Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
  8. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
  9. Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
  10. De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
  11. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
  12. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  13. Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
  14. Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
  15. Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
  16. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
  17. Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
  18. Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
  19. Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
  20. Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
  21. Dedkova, E. N., Blatter, L. A. Calcium signaling in cardiac mitochondria. J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).
  22. Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
  23. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
  24. Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
  25. Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
  26. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
  27. Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
  28. Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
  29. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  30. Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).

Play Video

Cite This Article
Maxwell, J. T., Tsai, C., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells. J. Vis. Exp. (134), e57225, doi:10.3791/57225 (2018).

View Video