Vi beskriver ett protokoll för prekliniska i vivo spårning av cancer metastaser. Den är baserad på en radionuklid-fluorescens reporter kombinerar den natrium jodid symporter, upptäcks av icke-invasiva [18F] tetrafluoroborat-PET, och en fluorescerande protein för strömlinjeformad ex vivo bekräftelse. Metoden är tillämplig för prekliniska i vivo cell tracking bortom tumörbiologi.
Metastaser är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer. Trots omfattande forskning fortfarande mekanistisk förståelse för de komplexa processer som reglerar metastaser ofullständigt. In vivo -modeller är avgörande för metastaser forskning, men kräver förfining. Spåra spontana metastaser av icke-invasiva i vivo imaging är nu möjligt, men fortsatt utmanande eftersom det kräver lång tid observation och hög känslighet. Vi beskriver en längsgående kombinerade radionuklid och fluorescens hela kroppen i vivo imaging strategi för att spåra tumör progression och spontana metastaser. Denna reporter gen metod sysselsätter den natrium jodid symporter (NIS) smält till en fluorescerande protein (FP). Cancerceller är konstruerad för att stabilt express NIS-FP följt av urval baserat på fluorescens-aktiverad cell sortering. Motsvarande tumör modeller är etablerade i möss. NIS-FP uttrycker cancerceller är spåras icke-invasivt i vivo på hela kroppen nivå av positronemissionstomografi (PET) använder NIS radiotracer [18F] BF4–. PET är för närvarande den mest känsliga i vivo imaging teknik som finns på denna skala och möjliggör tillförlitlig och absolut kvantifiering. Nuvarande metoder antingen lita på stora kohorter av djur som är euthanized för metastaser bedömning vid varierande tidpunkter eller förlita sig på knappt mätbara 2D imaging. Fördelarna med den beskrivna metoden är: (i) mycket känsliga icke-invasiv i vivo 3D PET imaging och kvantifiering, (ii) automatiserade PET tracer produktion, (iii) en betydande minskning krävs antalet djur på grund av upprepade imaging alternativ, (iv). förvärvet av Parade data från efterföljande imaging sessioner som ger bättre statistisk data och (v) alternativet inneboende för ex vivo bekräftelse av cancerceller i vävnader av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri. I detta protokoll beskriver vi alla steg som krävs för rutinmässig NIS-FP-ges icke-invasiv i vivo cancer cell spårning med hjälp av PET/CT och ex vivo bekräfta i vivo resultat. Detta protokoll har tillämpningar utöver cancerforskningen när i vivo lokalisering, expansion och long-time övervakning cell befolkningen är av intresse.
Metastaserande sjukdom är orsaken till de flesta dödsfall 1. Trots omfattande forskning om metastaserande processer är tillförlitlig övervakning av cancer metastaser i djurmodell system svårt att uppnå. Senaste framstegen inom hela kroppen imaging tekniker och multimodal imaging metoder har gjort det möjligt för icke-invasiv i vivo cell tracking2,3,4,5. Det senare kan användas som ett verktyg för att övervaka förekomsten, distribution, kvantitet och viabiliteten hos celler, icke-invasivt och upprepade gånger i ett levande djur eller en människa.
Syftet med den metod som beskrivs här är längdriktningen och icke-invasivt spåra cancerceller i 3D i levande gnagare tumör modeller. Med den här metoden kommer forskarna att kunna exakt kvantifiera tumör progression inklusive metastasering i 3D. Denna metod jämfört med traditionella icke-imaging-baserad teknik, och erbjuder förvärv av kvantitativa data med till stor del minskade antalet djur. En annan huvudnummer av den här metoden är att det tillåter korrelation i vivo Imaging med strömlinjeformad nedströms ex vivo analys av spårade cellerna i skördade vävnader av histologi eller flödescytometri3,6.
Den logiska grunden för utvecklingen av denna metod var att ge en in vivo -verktyg för övervakning och kvantifiering av hela metastaserande processen i gnagare tumör modeller. Viktigast av allt, var den avsedd att minimera användning av djur samtidigt som de minskar variabilitet. Längsgående noninvasiv hela kroppen imaging lämpar sig utmärkt att informera på metastaserad utväxt, för vilka i sig är det svårt att förutsäga exakt tid och plats för dess förekomst. Hela kroppen 3D imaging har därför varit i centrum för metodutveckling. För att stänga skala klyftan mellan hela kroppen i vivo antog imaging och potential nedströms ex vivo histologisk bekräftelse, en flerskalig imaging strategi baserad på en dual-mode radionuklid-fluorescens reporter var3, 6.
Positron emissions tomografi (PET) är den mest känsliga 3D hela kroppen bildteknik för närvarande tillgängliga erbjuder utmärkta djup penetration och absolut kvantifiering7 med en upplösning på < 1 mm8,9. För närvarande kan prekliniska cell tracking på nivån hela kroppen av radionuklid imaging tillförlitligt identifiera celler vid tätheter av ~ 1000 celler per volym miljon celler3,6 med resolutioner i regionen sub millimeter. Till skillnad från intravital mikroskopi, den skränande upptäcka enda sprida cancerceller, men det kräver kirurgiska ingrepp (t.ex. fönster kammare), är inte begränsad till ett litet synfält, och inte av låga vävnad penetration och scatter. Mareld imaging är ger ett billigt alternativ, men associerade med scatter och ljusabsorption frågor samt dålig djup penetration och följaktligen starkt begränsad i kvantifiering2. Fluorescens hela kroppen imaging har använts för förvärv av 3D-bilder, men det är mycket mindre känsliga jämfört med Mareld eller nukleärmedicinsk teknik2. Fluorescens erbjuder dock möjlighet att utföra ex vivo nedströms vävnadsanalys av flödescytometri eller mikroskopi. Den senare stänger skala-klyftan mellan makroskopiska hela kroppen imaging (mm upplösning) och fluorescens mikroskopiska vävnad analys (µm upplösning)3. Därför kompletterar radionuklid och fluorescens formerna varandra, alltifrån nivån hela kroppen till cellulära skalan (sub-).
Reporter gen imaging är idealiskt för långvarig cell spårning som krävs i metastaser forskning. I det här programmet det är överlägsen direkt cell märkning som det är (i) inte påverkas av etikett utspädning och således inte begränsad i spåra tid, och (ii) bättre återspeglar levande cell nummer. Följaktligen, hela kroppen cell tracking är särskilt användbara för tillämpningar där spårbara celler föröka eller expandera i vivo, till exempel i cancer forskning3,6, för detektion av teratoma bildandet i stammen cell forskning, eller för kvantifiering av immun cell expansion5.
Olika radionuklid-baserade reporter gener är tillgänglig2. Dessa inkluderar enzymer såsom herpes simplex virus HSV11 tymidinkinas (HSV1 –tk), transportörer såsom natrium jodid symporter (NIS) eller noradrenalin transportör (netto), samt ytan cellreceptorer såsom dopamin D2-receptorn ( D2R). NIS är ett glykosylerat trans-membran protein som aktivt förmedlar jodid upptag, till exempel i follikulära celler i sköldkörteln för efterföljande syntesen av sköldkörtelhormon10. Denna process drivs av en symport för Na+ och förlitar sig på den cellulära natrium lutningen, som upprätthålls av Na++k-ATPas11. Följaktligen, NIS bättre återspeglar levande cell nummer än andra reportrar som jodid/radiotracer upptag är kopplad till en aktiv Na+k+ lutning snarare än bara förekomsten av transportören. Traditionellt radioiodide har använts för NIS avbildning. För cell tracking, har alternativa NIS-radiotracers som inte är metaboliskt anhållna i sköldkörteln rapporterats vara överlägsen6. Detta nyligen utvecklat PET radiotracer [18F] tetrafluoroborat ([18F] BF4–)12,13 visar överlägsen farmakokinetiken jämfört med radioiodide6 samtidigt som tillgängliga på hög specifik verksamhet14 utan behov av komplexa radiokemi faciliteter. [18F] BF4– kan syntetiseras via två olika sätt. Den första metoden bygger på isotop utbyte av icke-radioaktiva 19F i BF4– med radioaktiva 18F12. Den andra metoden är genom tillägg av 18F till icke-radioaktiva boron Kvävetrifluorid14. Den senare metoden rapporterades att ge högre specifik verksamhet14 och är metoden för val av preklinisk imaging.
NIS uttrycks mycket i sköldkörteln vävnader. Det uttrycks också i saliv, lachrymal och digivande mjölkkörtlar samt magen, men på lägre nivåer jämfört med sköldkörteln10. Därför kan utmärkt kontrast imaging i andra organ regioner uppnås med NIS. Det är också mycket homologa mellan människa, råtta och mus10. Dessutom finns det inga rapporter om toxicitet vid ektopisk NIS uttryck i icke-thyroidal celler. Ännu viktigare, har NIS också inte associerats med värd immunsvar, varken människor eller gnagare. NIS har använts som en reporter gen för att mäta arrangören aktivitet15,16,17 och gen uttryck18,19,20,21,22 ,23 i flera olika sammanhang. Det har också använts för icke-invasiv imaging gen terapi vektorer24,25, och att spåra celler i hjärtats4, hematopoetiska26, inflammation5och neurala studier27. Nyligen, NIS har också använts som en reporter gen för att spåra cancer metastaser i vivo3,6.
Sammanfattningsvis är de främsta fördelarna med denna metod över tidigare tekniker: a mycket känsliga icke-invasiv 3D i vivo lokalisering och kvantifiering av metastatisk spridning, (ii) automatiserad produktion av [18F] BF4– på hög molar aktiviteter, (iii) en betydande minskning krävs djur genom längsgående imaging, (iv) förvärv av Parade data från efterföljande imaging sessioner vilket resulterar i förbättrad statistiska uppgifter, vilket i sin tur ytterligare minskar användning av djur, och (v) det inneboende alternativet för ex vivo bekräftelse av cancerceller i vävnader med hjälp av flödescytometri eller fluorescence mikroskopi.
Det första steget att återge cancer celler spårbar i vivo genom denna metod kräver engineering dem uttrycka NIS-FP fusion reportern. Valet av fluorescerande protein i fusion reportern är kritisk som oligomerizing fluorescerande proteiner kan leda till konstgjorda reporter klustring, därmed negativt påverkar dess funktion. Vi har haft framgång med beprövade monomer fluorescerande proteiner som mEGFP (med monomerizing-mutationen A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan antingen vara av mänskliga eller mus ursprung (HNI eller msNIS) beroende på syftet med försöket och cancer modell. Transduktion effektivitet varierar i allmänhet mellan olika cancer cellinjer. Dock renas genererade cancer cellinjer därefter av FACS i detta protokoll, vilket minskar behovet av att optimera transduktion villkor. Transduktion med hög multiplicity av infektion är inte alltid tillrådligt eftersom flera construct integrering i genomet sannolikt resulterar inte bara i högre konstruera uttryck, men också mer oönskade/oreglerad genomet modifiering. Det är därför viktigt att låta polyklonala sensorik celler växer till stabiliteten i uttryck (övervakas av flödescytometri) och undvika sortering ljusaste klonerna endast av FACS. Det gör även funktionella validering av icke-reporter funktioner avgörande innan dessa celler bör användas för in-vivo -experiment. Ett nyligen utvecklat alternativ till viral genen leverans är genen redigering teknik38, som erbjuder mer specifik kontroll över viral integration webbplatser. Uttryck analys av flödescytometri och immunoblotting är viktigt. Flödescytometri tillåter förvärv av populationsbaserade enda celldata, exempelvis att undersöka huruvida det finns någon drift i reporter uttryck nivåer över tid. Det bygger på den FP-biexponentiellt endast, om inte cellerna färgas också med en antikropp riktad mot ytan eller totala NIS. Flödescytometri informerar inte på fusion reporter integritet. Däremot rapporterar immunoblotting integritet av fusion reporter. Molekylvikten för NIS och FP måste läggas till avgöra den valda NIS-FP. Confocal fluorescence mikroskopi visade fusion reporter colocalization med de plasmamembran markör vetegroddar agglutinin i alla förväntade molekylvikt nyligen gjorde cellinjer. Detta var den förväntade cellulära platsen för de flesta av protein och anges en klartecken milstolpe för efterföljande funktionella validering. Om minimal/inget NIS-FP hittades på plasmamembranet (t.ex. endast i inre cellulära fack), detta skulle innebära ett cell biologiska problem med fusion reporter i denna cell linje, eller en potentiell mutation av fusion reporter som påverkar dess intracellulära människohandel. Det är anmärkningsvärt att vi inte har observerat sådant fall i någon av de cancerceller som vi testat hittills, och som ingår: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (mänskliga melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (mänskliga bröstcancer); NCI-H1975 (mänskliga lungcancer); SK-Hep1 (mänskliga levercancer); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murina inflammatorisk bröstcancer); B16F0, B16F3, B16F10 (murina melanom); MTLn3 (råtta bröst adenocarcinom).
NIS funktion måste mätas med upptag analyser med radioaktiva NIS substrat. På grund av den SPECT radiotracer 99 mTcO4– som generator-producerade och därför allmänt tillgänglig på sjukhus utan behov av någon radiotracer syntes samt ha en bekvämare längre halveringstid (6.01 h för 99 m TC jämfört med 110 min för 18F), vi använde detta NIS substrat för rutinmässig funktionella validering av nya NIS-FP uttrycker cellinjer. Pre blockering av NIS-uttryckande celler med de NIS samtidig substrat natrium perklorat resulterade i förväntad minskning/abolishmenten av radiotracer upptag, därmed visar specificiteten av radiotracer upptag. Detta NIS specificitet test är en kritisk valideringsstegen. Om ett NIS specificitet experiment inte skulle leda till minskad radiotracer upptag jämförbar med respektive föräldrarnas cellerna, antingen ett tekniskt fel under experimentet har uppstått eller radiotracer upptaget berodde inte på NIS. Det är också möjligt att natrium perklorat pre blockering minskar radiotracer upptag i en Föräldrakontroll cell fodrar; Detta skulle identifiera cellinjer med endogena funktionella NIS uttryck (t.ex. stimuleras sköldkörtel cellerna6).
En avgörande fördel av detta protokoll-avbildning är att information som samlas in i 3D och över tid. Detta tillåter jämförelse av bilder från samma djur över tid, vilket ger Parade data och därmed övervinna de problem som orsakas av variabilitet. Detta kontrasterar mot mest icke-imaging relaterade metastaser bedömningsmetoder som baseras på att offra olika djur vid olika tidpunkter. I figur 3B är det uppenbart hur metastatisk spridning och utväxt utvecklats över tiden i ett enskilt djur. De signaler som upptäcks av PET/CT imaging grunden orsakade av NIS uttryck. Detta omfattar alla signaler från exogent NIS-uttryckande cancerceller samt alla organ endogenously uttrycker NIS. Typiska endogena NIS signaler finns i sköldkörteln och spottkörtlar, magen, och på låga nivåer i vissa delar av mjölkkörtlar och tårfilmens körtlar. Utöver endogena NIS uttryck utsöndras NIS radiotracer [18F] BF4– också via njurarna, därmed förklarar radiotracer upptag i urinen-fyllda blåsor. Njure upptag är inte längre detekterbar den imaging tidpunkt rekommenderas i detta protokoll (45 min post radiotracer injektion6). Om signalerna från urin-fyllda blåsor bör leda till signal till bakgrunden problem, kan blåsan tömmas mekaniskt under narkos innan imaging. Ännu viktigare, kan de endogena signalerna variera mellan djur stammar. Det är också anmärkningsvärt att endogena NIS uttryck i mjölkkörtlar kan vara högre under lakterande villkor10. I presenterade fall och i fall av dessa metastaserande cellinjer som framgångsrikt kännetecknas innan (jfr listan ovan), vi inte hitta endogen NIS uttryck att kraftigt störa metastaser upptäckt. Det är anmärkningsvärt, att [18F] BF4– förblir mer tillgänglig för upptag i cancervävnader jämfört med jodid, eftersom jodid metaboliseras till sköldkörtelhormoner6. Detta fenomen kan också bidra till större mängder av radioiodide i blodet jämfört med [18F] BF4– 6. Detta skilja sig för olika applikationer (cancercell tracking i andra cancerformer eller icke-cancer cell tracking program), och det rekommenderas därför att bedöma om endogena NIS uttryck är sannolikt att orsaka signal till bakgrunden problem genom preliminära experiment. En viktig aspekt inom preklinisk imaging är radiotracer molar verksamhet. Den metod som beskrivs här använder ~1.5 GBq 18F– som start material14 och har visat sig producera molar aktiviteter avsevärt över den tidigare rapporterade substitution metod12. [18F] BF4– producerat molara aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan leda till reducerat upptag i NIS-uttryckande vävnader. Detta är särskilt viktigt när den injicerade mängden radioaktivitet per kilo är hög, dvs när små djur som möss avbildas39; Det är mindre viktigt i den mänskliga inställning40. Hög molar verksamhet är därför absolut nödvändigt för hög kvalitet preklinisk PET imaging. Molar verksamhet erhålls genom boron Kvävetrifluorid tillägg metod14, som visas i sin automatiserad form i detta protokoll, övervinna problemet. Dessutom är det anmärkningsvärt att protokollet presenteras för [18F] BF4– syntes inte är kompatibel med god tillverkningssed (GMP) och därför olämpliga för användning i kliniska prövningar i det här formuläret. En GMP-protokollet (via 18F substitutionsmetoden till radiomärkas BF4–) är tillgängligt någon annanstans40.
PET/CT imaging tillåter visualisering av radiotracer upptag, vilket är vägledande av NIS-medierad radiotracer upptag som härrör från NIS-FP uttrycker cancerceller. Viktigare, kan de associera PET-signalerna kvantifieras. Det är nödvändigt att tillämpa tillförlitlig tröskelvärde förfaranden för att säkerställa en enhetlig och objektiv differentiering av relevanta signaler från alla potentiella bakgrund. Som bakgrund varierar i olika platser i vivo, är det viktigt att beakta lokala och regionala tröskelvärde och segmentering. En sådan metod utvecklades av och uppkallad efter Otsu34, och dess 3D genomförande är anställd för 3D-rendering av primärtumör och metastaser i detta protokoll. Bilden sett observatören visuellt motsvarar i allmänhet bäst på de kvantifierade % injicerat dosen (% ID) värdena. När det gäller image-baserad kvantifiering är det också viktigt att normalisera värdena uppmätta radioaktivitet i olika vävnader till deras volymer. Det finns två huvudsakligen använda sätt att uttrycka normaliserade resultat, a %-ID per volym (t.ex. %ID/mL), och (ii) standard upptag värde (SUV35). De skiljer sig i att %ID/mL tar hänsyn till den enskilda volymen bara, medan SUV är ett mått som är i förhållande till den genomsnittliga radioaktiviteten över hela djuret. Det är också viktigt att notera att NIS imaging gör den levande tumör volymen (LTV) tillgängliga, eftersom död/döende celler inte syntetisera ATP kan inte längre importera radiotracer10. Detta förklarar det stora låg-signal området inom den primära tumören (”donut formade” tumör) som indikerar områden av tumör cell death/nekros. Huvudsakligen, var LTV ett mycket mer tillförlitliga mått på tumör börda jämfört med rå tumör volym nås med skjutmått mätningar (som inte tar in i konto livskraft och bedömer endast ytlig tumör regioner).
En stor fördel med denna dubbla lägen spårning strategi är uppenbart när skörda vävnader efter djur avlivats. Biträdd av fluorescerande cancerceller under djurens dissektion och styrs av i vivo bilder, kan små och djupt liggande organ/metastaser också på ett tillförlitligt sätt skördas. Fryst vävnad bevarande/snittning metod möjliggör direkt fluorescens bildtagning av GFP utan behov av färgning med en anti-GFP-antikropp, men på bekostnad av minskad strukturella vävnad bevarande jämfört med formalin-fasta paraffin-inbäddat metodik (FFPE). Den senare kräver kritiskt också anti-FP färgning, eftersom FFPE är oförenlig med intakt bevarandet av fluorescerande proteiner (på grund av fixering/uttorkning/rehydrering). Medan fluorescens-signalen är ett tecken på tumör cell närvaro, är det viktigt att säkerställa denna klassificering bekräftas av ex vivo radioaktivitet mätningar av de skördade vävnaderna (‘biodistribution’). Ex vivo radioaktivitet mätningar är mer känsliga än visuell identifiering av fluorescens, därmed kan tillåta identifiering av cancer cell-beroende signaler som annars skulle förbli oupptäckta. Vid en terminal imaging session, det är viktigt att noggrant notera de injicerade radiotracer belopp samt tider av radiotracer radioaktivitet mätningar, djur injektion, djur som avlivats och kalibrerad scintillationsräknare mätningar av skördade vävnader. Detta är avgörande för att säkerställa korrigering för radiotracer sönderfall och därmed möjliggöra tillförlitliga biodistribution analys.
PET/CT imaging möjliggör upprepade noninvasiv 3D kvantifiering av tumör progression inklusive bedömning av metastasering på hela kroppen nivå. Denna funktion är en signifikant fördel jämfört med konventionella metoder, som förlitar sig ofta på stora kohorter av djur som är euthanized för bedömning av tumör progression vid varierande tidpunkter. Fördelarna med detta imaging-baserat tillvägagångssätt är: (i) mycket känsliga icke-invasiv 3D i vivo kvantifiering, (ii) en betydande minskning av antalet djur på grund av möjligheten att upprepa imaging, (iii) förvärv av longitudinella kopplade data från efterföljande imaging sessioner att förbättra statistiken genom att utesluta variabilitet, vilket i sin tur ytterligare minskar antalet djur, (iv) automatiserad produktion av [18F] BF4– på hög specifik verksamhet, och (v) den inneboende alternativ för ex vivo bekräftelse i vävnader av fluorescens metoder såsom mikroskopi eller flödescytometri.
In vivo cell tracking är ett växande område. Det har drivits av senaste framsteg i imaging teknik, vilket resulterade i förbättrad upplösning, detektionsgränser och multiplex kapacitet (via multimodal imaging). I detta protokoll tillämpar vi detta koncept för att spåra tumör progression inklusive spontana cancer cell metastaser i 3D genom att upprepa imaging. Tillämpningar inkluderar studier syftar till att nysta upp mekanismer för spontana cancer cell metastaser. Spårbar tumörceller kunde exempelvis användas för att studera effekterna av olika immunceller komponenter (som för närvarande/funktionell i djura stammar av olika nivåer av immunocompromisation) på metastaserad processen. På samma sätt kunde effekten av enskilda gener, antingen i den animaliska stammen eller raden cancer cell, studeras. Dessutom kunde presenteras protokollet användas för att bedöma/validera effekten av specifika läkemedel eller terapeutiska begrepp på tumör progression. Allt detta reporter gen: radiotracer par för PET imaging (NIS: [18F] BF4–) kan också användas för annan cell spårningsprogram. Exempelvis finns flera cellterapi för närvarande nya så lovande behandlingsmetoder. Detta inkluderar cellulär therapeutics för cancer behandling41 men också transplantation42 och regenerativ medicin43,44 inställningar. Hela kroppen i vivo cell tracking blir allt viktigare för utveckling och klinisk översättning av cellulära therapeutics, exempelvis för att utvärdera säkerheten och för övervakning av terapi.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen stöddes av King’s College London och UCL omfattande Cancer Imaging Centre, finansieras av Cancer Research UK och EPSRC i samarbete med MRC och DoH (England); National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre baserat på Guy’s and St Thomas’ NHS Foundation Trust och King’s College London; Centre of Excellence i medicinsk teknik finansieras av Wellcome Trust och EPSRC under grant nummer WT 088641/Z/09/Z; en Cancer Research UK tvärvetenskapliga projekt Award till GOF PJB och en King’s Health Partners bidrag till GOF. NanoPET/CT och nanoSPECT/CT scanners köptes och underhålls av en utrustning bidrag från Wellcome Trust. De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR eller DoH.
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |