Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Alessia Volpe; Francis Man; Lindsay Lim; Alex Khoshnevisan; Julia Blower; Philip J. Blower; Gilbert O. Fruhwirth

doi:10.3791/57088

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Cancer Research

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Published: March 13, 2018

doi:

10.3791/57088

Alessia Volpe¹, Francis Man¹, Lindsay Lim¹, Alex Khoshnevisan¹, Julia Blower¹, Philip J. Blower¹, Gilbert O. Fruhwirth¹

¹Department of Imaging Chemistry and Biology, School of Biomedical Engineering and Imaging Sciences,King’s College London

Summary

Les auteurs décrivent un protocole précliniques in vivo suivi des métastases cancéreuses. Il est issu d’un reporter de radionucléide-fluorescence combinant le sodium iodure symport, détecté par non invasive [¹⁸F] tétrafluoroborate-PET et une protéine fluorescente simplifiée ex vivo de confirmation. La méthode est applicable pour précliniques in vivo la cellule de suivi au-delà de biologie tumorale.

Abstract

Métastase est responsable de la plupart des décès de cancer. Malgré des recherches approfondies, l’interprétation mécaniste des processus complexes qui régissent les métastases demeure incomplète. In vivo modèles sont primordiaux pour la recherche de métastases, mais nécessitent de raffinement. Métastase spontanée de suivi non invasif en vivo imagerie est maintenant possible, mais il reste difficile car elle nécessite une observation longue et haute sensibilité. Nous décrivons une longitudinale combiné radionucléide et fluorescence confiné en vivo imagerie approche pour le suivi de la progression tumorale et les métastases spontanées. Cette méthodologie de gène de journaliste emploie le symporteur de l’iodure de sodium (NIS) fusionné à une protéine fluorescente (FP). Cellules cancéreuses sont machinés pour stablement express NIS-FP, suivie par la sélection basée sur le tri cellulaire activés par fluorescence. Modèles correspondants de tumeur sont établis chez les souris. NIS-FP exprimant des cellules cancéreuses sont suivies non invasive en vivo au niveau du corps entier par tomographie par émission de positrons (TEP) à l’aide de la SNI traceurs radioactifs [¹⁸F] BF₄^–. Animal de compagnie est actuellement le plus sensible en vivo disponible à l’échelle de cette technologie d’imagerie et permet une quantification fiable et absolue. Les méthodes actuelles s’appuient sur des cohortes d’animaux qui sont euthanasiés pour évaluation de métastases à différents points dans le temps ou s’appuient sur l’imagerie 2D à peine quantifiable. Les avantages de la méthode décrite sont : PET traceur production, (iii) une réduction significative en nombre d’animaux requis grâce à des options d’imagerie répétition, hautement sensibles non invasif en vivo 3D TEP et la quantification, (ii) automatisée (iv). l’acquisition de données appariées de ses sessions ultérieures d’imagerie offrant le mieux les données statistiques et (v) l’option intrinsèque ex vivo confirmation des cellules cancéreuses dans les tissus par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. Dans ce protocole, nous décrire toutes les étapes requises pour systématique NIS-FP-offerte non invasif en vivo cancer cellule suivi à l’aide de la TEP/CT et ex vivo confirmation en vivo desrésultats. Ce protocole a applications au-delà de recherche sur le cancer, chaque fois qu’in vivo de localisation, d’expansion et de surveillance de longue date d’une population de cellules est intéressant.

Introduction

Maladie métastatique est la cause de la plupart des décès liés au cancer ¹. Malgré des recherches approfondies dans les processus métastatiques, surveillance fiable des métastases cancéreuses dans des systèmes modèles animaux est difficile à réaliser. Les progrès récents dans les technologies d’imagerie corporelle et des approches d’imagerie multimodales ont permis non invasif en vivo cellulaire, suivi de²^,³^,⁴^,⁵. Ce dernier peut être utilisé comme un outil pour contrôler la présence, la distribution, la quantité et la viabilité des cellules, non invasive et à plusieurs reprises à un animal vivant ou un être humain.

Le but de la méthode décrite ici est pour suivre les cellules cancéreuses en 3D dans des modèles de tumeur rongeurs vivants longitudinalement et non invasive. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de quantifier avec précision la progression tumorale dont les métastases en 3D. Par rapport aux techniques traditionnelles non dotés d’imagerie, cette méthode propose l’acquisition de données quantitatives avec nombre d’animaux fortement réduite. Une autre caractéristique de cette méthode est qu’il permet la corrélation entre l’imagerie in vivo et simplifiée en aval ex vivo analyse des chenilles cellules dans les tissus récoltés par histologie ou cytométrie³^,⁶.

La justification de l’élaboration de cette méthode était de fournir un outil in vivo pour la surveillance et à la quantification du processus métastatique ensemble dans les modèles de rongeurs tumeur. Ce qui est important, il a été conçu pour minimiser l’utilisation des animaux tout en réduisant les animaux. Longitudinale imagerie non invasive de tout le corps convient parfaitement pour informer sur l’excroissance métastatique, pour laquelle en soi , il est difficile de prédire avec précision l’heure et le lieu de son apparition. Imagerie 3D confiné a donc été au centre de développement de la méthode. Pour combler cet écart d’échelle entre le corps entier en vivo imagerie et potentiel en aval ex vivo confirmation histologique, une multi-échelle approche d’imagerie basée sur un journaliste bi-mode radionucléide-fluorescence a été adopté³^, ⁶.

Par émission de positrons (TEP) est la plus sensible confiné technologie d’imagerie 3D actuellement disponible offrant profondeur excellente pénétration et quantification absolue de⁷ avec une résolution de < 1 mm⁸^,⁹. Actuellement, préclinique cellule de suivi au niveau du corps entier par scintigraphie peut détecter de manière fiable des cellules à des densités de ~ 1 000 cellules par volume de 1 million de cellules³^,⁶ résolutions dans la région de submillimétrique. Contrairement à la microscopie intravitale, il ne peut pas détecter les cellules cancéreuses épandage unique, mais il ne nécessite pas d’interventions chirurgicales (par exemple les chambres de fenêtre), n’est pas limité à un petit champ de vue et non par scatter et pénétration tissulaire faible. Bioluminescence imagerie fournit une alternative peu coûteuse, mais est associée à la dispersion et absorption de la lumière des questions ainsi que pénétration de faible profondeur et par conséquent fortement limitée dans la quantification². Imagerie de fluorescence corps entier a été utilisé pour l’acquisition d’images 3D, mais il est beaucoup moins sensible par rapport à la bioluminescence ou radionucléides technologies². Néanmoins, fluorescence offre la possibilité d’effectuer ex vivo des tissus en aval analyse en cytométrie en flux ou en microscopie. Ce dernier ferme l’échelle-écart entre l’imagerie corporelle macroscopique (résolution mm) et fluorescence tissulaires microscopiques analyse (résolution µm)³. Par conséquent, modalités de détection des radionucléides et fluorescence complètent mutuellement, allant du niveau de l’ensemble du corps à l’échelle cellulaire (sous-).

Imagerie de gène de journaliste est idéal pour cellulaire prolongé suivi tel que requis dans la recherche de métastases. Dans cette application, il est supérieur aux cellules direct d’étiquetage il est (i) pas affecté par la dilution de l’étiquette et donc pas limité dans le temps et (ii) mieux refléter les nombres de cellules vivantes. Par conséquent, tout le corps cellulaire suivi est particulièrement utile pour les applications dans lequel traçables cellules prolifèrent ou développez in vivo, par exemple, dans le cancer recherche³^,⁶, pour la détection de la formation de tératome dans la tige recherche de cellules, ou pour la quantification des immunitaire cellulaire expansion⁵.

Divers gènes axée sur les radionucléides sont disponibles². Ceux-ci incluent enzymes telles que l’herpès simplex virus HSV11 la thymidine kinase (HSV1 –tk), les transporteurs tels que le symporteur de l’iodure de sodium (NIS) ou le transporteur de la noradrénaline (NET), ainsi que des récepteurs de surface cellulaire telles que la dopamine D2 récepteurs) D2R). NIS est une protéine glycosylée membranaires qui intervient activement dans l’absorption iodure, par exemple dans les cellules folliculaires de la thyroïde pour la synthèse subséquente des hormones thyroïdiennes¹⁰. Ce processus est piloté par le symport Na⁺ et s’appuie sur le gradient de sodium cellulaire qui est maintenu par la Na⁺/k⁺-ATPase¹¹. Par conséquent, NIS reflète mieux la vie cellulaire nombre que les autres journalistes comme captation iodure/traceurs radioactifs est liée à un actif Na⁺/k⁺ dégradé plutôt que la simple présence du transporteur. Traditionnellement, les radioiodure a été utilisé pour l’imagerie de NIS. Pour le suivi de la cellule, des radiotraceurs NIS alternatifs qui ne sont pas métaboliquement piégés dans la thyroïde ont été signalés à être supérieure de⁶. Cela s’est développé récemment PET tétrafluoroborate de traceurs radioactifs [¹⁸F] ([¹⁸F] BF₄^–)¹²^,¹³ présente une pharmacocinétique supérieure par rapport aux radioiodure⁶ tout en étant disponible à une activité spécifique élevée¹⁴ sans la nécessité d’installations complexes de radiochimie. [¹⁸F] BF₄^– peuvent être synthétisés par l’intermédiaire de deux façons différentes. La première méthode est basée sur l’échange des isotopes non radioactifs ¹⁹F BF₄^– avec radioactif ¹⁸F¹². La deuxième méthode est par ajout de ¹⁸F au trifluorure de bore non-radioactifs¹⁴. Cette dernière méthode a été signalée à rendement plus élevé des activités spécifiques¹⁴ et est la méthode de choix pour l’imagerie préclinique.

NIS est fortement exprimée dans les tissus de la thyroïde. Elle est également exprimée dans les glandes mammaires salivaires, lacrymales et allaitantes ainsi que l’estomac, mais à des niveaux inférieurs par rapport à la glande thyroïde¹⁰. Par conséquent, imagerie de contraste excellent dans d’autres régions du corps peut être réalisé à l’aide de NIS. Il est également très homologue entre l’humain, le rat et la souris¹⁰. En outre, il n’y a aucun cas de toxicité sur l’expression ectopique NIS dans les cellules non-thyroïdien. Ce qui est important, NIS a également pas été associé immunitaire h6te, ni chez l’homme, ni chez les rongeurs. NIS a été utilisé comme un gène rapporteur pour mesurer le promoteur activité¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ et gene expression¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²² ^,²³ dans plusieurs contextes différents. Il a également été utilisé pour l’imagerie non invasive du gène thérapie vecteurs²⁴^,²⁵et de suivre les cellules cardiaque⁴, hématopoïétiques²⁶, inflammation⁵et études neural²⁷. Récemment, NIS a également été utilisé comme un gène rapporteur pour suivre les métastases de cancer en vivo³^,⁶.

En résumé, les principaux avantages de cette méthode sur les techniques précédentes sont : (i) très sensible non invasif 3D in vivo de localisation et quantification des métastatique réparties, (ii) production automatisée de [¹⁸F] BF₄^– à activité molaire élevée, (iii) une réduction significative des animaux requis par imagerie longitudinale, (iv) l’acquisition des données appariées de ses sessions ultérieures d’imagerie aboutissant à des données statistiques améliorées, qui réduit davantage l’utilisation des animaux et (v) l’option intrinsèque ex vivo confirmation des cellules cancéreuses dans les tissus par cytométrie en flux ou fluorescence microscopy.

Protocol

Ce protocole respecte toutes les exigences fixées par la législation du Royaume-Uni (UK) et le Comité d’examen éthique local. En suivant ce protocole, s’assurer que les procédures aussi rencontrer toutes les exigences dictées par la législation nationale et locale Ethical Review panel. S’assurer que chaque expérience impliquant la radioactivité est conforme aux lois et aux règles locales et exécutées en toute sécurité. 1. le génie et la caractérisation des cellules cancéreuses pour exprimer le reporter de fusion de radionucléide-fluorescence NIS-FP Remarque : Pour plus de simplicité, mEGFP A206K est abrégé en « GFP » et mCherry comme « DP » dans les sections suivantes du présent protocole. Génération de Particules Lentivirales Pour produire des particules de lentivirus, co transfecter cellules 293 t avec les quatre plasmides suivants en utilisant une méthode de transfection appropriée : (i) le gène rapporteur codant le plasmide (pLNT SFFV NIS-GFP ou pLNT SFFV NIS-DP (voir renseignements supplémentaires), (ii) les troisième génération des gènes emballage plasmides pRRE et (iii) pRSV-Rev et plasmide (iv) une enveloppe contenant des virus, par exemple, pMD2.G. Plasmides de pré-mix avant de les ajouter au mélange de transfection. Effectuer la transfection dans une hotte de culture cellulaire.NOTE : Transfection supplémentaires information est fournie dans les informations complémentaires. Évaluer le succès de transfection après 48 h de fluorecence grand-angulaire standard avec les paramètres de filtre appropriés pour le reporter de fusion choisie (GFP-NIS ou NIS-DP).NOTE : Signaux fluorescents sont indicatifs de la transfection du gène rapporteur et par conséquent seul un substitut pour la transfection de collaboration réussie, pas un indicateur de la production de virus avec succès. Récolter le surnageant contenant des particules de virus à l’aide d’une seringue et enlever les cellules flottantes et des débris cellulaires en filtrant à travers un filtre stérile polyéthersulfone (PES) de 0,45 µm. Transférer dans un tube de réaction en polypropylène stérile de 1,5 mL. Réaliser des travaux de virus dans une hotte de culture cellulaire et s’assurer que l’environnement confiné ne laisse aucun virus vivant. La transduction et la sélection des lignées de cellules cancéreuses exprime NIS-FP Utiliser pure virus fraîches de l’étape 1.1.3 mixé 1:1 (v/v) avec le milieu de croissance optimale de chaque lignée de cellules cancéreuses (DMEM pour cellules MDA-MB-231 et RPMI 1640 pour les cellules 4 t 1 ; voir tableau des matériaux pour la composition des médias). La transduction sous une hotte de culture cellulaire.Remarque : Un protocole plus général est désigné dans informations complémentaires. Transmettre des cellules cancéreuses avec contenant le virus moyen dans un incubateur avec atmosphère humidifiée contenant 5 % (v/v) de CO2 à 37 ° C pendant 72 h (travail à l’échelle 6 puits ou 12 puits à l’aide de 1 mL ou 0,4 mL du mélange de l’étape 1.2.1 virus). Surveiller les expression de NIS-FP de cellule cible en microscopie par fluorescence. Développez des cellules transduits avec succès à une échelle de 3 millions de cellules à l’aide de conditions de culture standard (voir ATCC pour les lignées de cellules MDA-MB-231 et 4 t 1). Cellule activée par fluorescence (FACS) de tri permet de purifier les cellules exprimant NIS-FP de cellules transduites non.Remarque : Les FACS peuvent être une source d’infections à mycoplasma ; Il est recommandé de vérifier pour le mycoplasma avant la production de virus et de transduction mais aussi après les FACS et avant l’étape 1.3. Lignées cellulaires cancéreuses exprime de caractérisation NIS-FP Confirmez expression du rapporteur en cytométrie standard comme décrit ailleurs28. Confirmer l’intégrité de la journaliste par immunotransfert standard telle que décrite ailleurs29. Analyser les localisation journaliste fusion intracellulaire par microscopie confocal fluorescence.Remarque : Avec la coloration ou la co-expression d’une membrane plasmique marqueur6 et ultérieures de co-localisation analyse30 permettra de faciliter cette étape. Analyser la captation du radiotraceur dans les lignées cellulaires exprime de NIS-FP.Remarque : N’importe quel substrat radioactif de NIS compatible avec le matériel existant est approprié, par exemple les isotopes de l’iodure (123j’ai-, 124I-, 125j’ai-, 131j’ai–), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] afin que la3F– ou [18F] BF4–. Purifiée de semences 106 cellules en plaques 6 puits dans leur milieu de croissance optimale (voir Table des matières) un jour avant l’expérience. Préparer tous les échantillons en triple exemplaire et comprennent des échantillons témoins : (i) « contrôles de spécificité », c’est-à-dire NIS-FP des cellules exprimant des incubés avec un concurrentiel NIS pour tester la spécificité d’absorption ; (ii) « contrôles de cellules parentales », c’est-à-dire des cellules n’exprimant ne pas NIS-FP, mais recevant à traceurs radioactifs pour tester basale absorption dans les cellules parentales. Le lendemain matin, lavez les cellules une fois avec le milieu de culture sans sérum. Incuber les cellules dans un milieu sans sérum croissance en présence de 50 kBq m 99TcO4– ou [18F] BF4– pendant 30 min à 37 ° C (volume total de 1 mL). Pour les contrôles de la spécificité, les incuber les cellules pendant 30 min avec le substrat compétitif NaClO4– (concentration finale de 12,5 µM). La concentration du substrat compétitif maintenir constante tout au long de l’expérience. Récupérer le surnageant et transférer 100 µL dans un tube de prélèvement préparés étiqueté « surnageant ». Laver les cellules deux fois avec 1 mL glacee tampon phosphate salin (PBS) contenant Ca2 +/Mg2 +. Collecter chaque solution de lavage et transférer 100 µL de chacune dans un tube de prélèvement préparés portant la mention « wash1 » ou « wash2 », respectivement. Soulevez les cellules en ajoutant 500 µL PBS contenant la trypsine 0,25 % (p/v) et 0,53 mM EDTA et en laissant incuber à 37 ° C jusqu’à ce que les cellules se détachement (vérifier visuellement à l’aide d’un microscope). Transférer la suspension dans un tube de prélèvement préparés étiqueté « cellules ». Laver les puits avec 500 µL glacee PBS contenant Ca2 +/Mg2 + et ajouter dans le tube « cellules ». Les cellules de granule par centrifugation (250 x g, 4 min, 4 ° C). Comte tous les quatre types d’échantillons de chaque bien en utilisant un gamma contrer convenablement définie pour les radio-isotopes de choix (ici : 99 mTc ou 18F).Remarque : En raison du grand nombre d’échantillons dans cet essai, il est recommandé d’utiliser un γ-compteur automatisé capable de correction automatique de désintégration. Analyser les données en additionnant les comtes de gamma obtenues d’échantillons provenant de chaque puits pour déterminer un nombre de radioactivité totale par puits.NOTE : prendre toutes étapes 1.3.4.4 et 1.3.4.5 compte par numéros de multiplication par 10 pour « surnageant » et « laver » fractions. Exprimer l’absorption cellulaire de traceurs radioactifs en % l’absorption comme indiqué dans Equ.1. Calculer les moyennes et écarts-types d’expériences en triple.(Equ.1)NOTE : Ici, les expériences de validation journaliste sont décrits, mais non liées à la journaliste de fonctions cellulaires (par exemple la prolifération, invasion des cellules du cancer, l’expression des gènes etc.) sont en fin de compte spécifique à l’application et la responsabilité de chaque utilisateur. 2. création de modèles de tumeurs in vivo Utiliser seulement entièrement caractérisé et validées pour des expériences in vivo des cellules. Vérifier la fluorescence des cellules avant l’administration par n’importe quelle technique approprié (par exemple la microscopie en fluorescence, cytométrie en flux) à chaque occasion. Établir le modèle de tumeurs chez les souris femelles jeunes adultes âgés de 5 à 6 semaines. Utilisez BALB/cAnNCrl ou souris BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (nu BALB/c) pour le modèle de tumeur 4 t 1 et clin de œil. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ souris (NSG) pour le modèle de tumeur base de MDA-MB-231. Râper les animaux localement et utiliser une technique aseptique. Injecter directement 50 µL d’une suspension contenant 106 NIS-FP exprimant le cancer cellules/mL dans les coussinets adipeux mammaire entre la quatrième et la cinquième de mamelon31.Remarque : Pour améliorer la précision de l’injection, il est recommandé effectuer l’injection sous anesthésie générale à l’aide d’un anesthésique inhalable comme l’isoflurane (1-2 % (v/v) de O2).Remarque : L’implantation chirurgicale de morceaux de tumeur de tumeurs exprimant NIS-FP est une approche alternative de la tumeur de mise en place du modèle31. Vérifier la fluorescence des cellules aux sites d’injection après l’administration et dans la premiers jours post injection. Utilisez une fluorescence torche et filtre verres convenant à la FP de choix. Surveiller la croissance tumorale et Rechercher des signes cliniques (notamment à des moments plus tard).Remarque : Pour les tumeurs superficielles, c’est-à-dire l’orthotopic sein tumeurs dans ce protocole, utilisation étriers et la formule pour le diamètre moyen de tumeur (MTD) = ½· (L + L) 32. 3. production de [18 F] BF 4– à l’aide d’une plate-forme de synthèse (ARS) de traceurs radioactifs automatisé. NOTE : Ici, la synthèse de4– de BF automatisés [18F] basée sur la méthode d’addition de 18F de trifluorure de bore est décrite. Les utilisateurs d’une plateforme ARS plus largement disponible (voir Table des matières), pouvez télécharger le fichier correspondant de langage de balisage Extensible (XML) nécessaire à l’exécution de la séquence automatique sur cette plate-forme (fichier supplémentaire). Une explication détaillée de la mise en page de cassette illustré à la Figure 1 est fournie (tableau 1) ainsi qu’une description détaillée de chaque étape dans le fichier de séquence XML (tableau 2) à l’appui de traduction à n’importe quelle autre plateforme automatisée. Mettre en place la plateforme ARS tel que décrit dans le tableau 1 et assurez-vous qu’il est opérationnel avec le bon fichier XML chargé sur l’ordinateur de contrôle. S’assurer que la plate-forme de l’ARS est placée dans une hotte chimique convenant au travail sécuritaire avec GBq quantités de radioactivité. Aspirer le cyclotron-produites [18F] F– (généralement GBq de 1,5 à 2 mL 2-7 [18O] H2O) via le réservoir d’aspiration (V6). Piège de la radioactivité sur une résine échangeuse d’anions (p. ex. d’ammonium quaternaire anion exchange cartouche ; V5 à V4), récupérer le [18O] H2O (V1) dans une cuvette séparée. Éluer la [18F] F– (inverse d’élution, V5 vers V4) dans le réacteur (V8) avec 750 µL de solution saline à 0,9 % (p/v) (V2), suivi de 1,5 mL d’acétonitrile (V16). Enlevez l’eau par évaporation azéotropique en écoulement de vide et de l’azote en chauffant à 105 ° C puis à 120 ° C pendant 5 min. Réduire la température du réacteur à 80 ° C. Ajouter 800 µL de 15-couronne-5 dans l’acétonitrile anhydre (46 mg, 0.21 mmol) dans le sec [18F] F– via le port central du réacteur (V8). Ajouter 850 µL de BF3. OEt2 dans l’acétonitrile anhydre (0,16 mg, 1.13 µmol) dans le réacteur. Réagir pendant 5 min, alors qu’il revenait à la température ambiante. Passer le mélange réactionnel dans une cartouche d’oxyde d’aluminium (V17 à V18) pour piéger le trifluoroborate. Retourner le mélange réactionnel à seringue S2 et diluer avec de l’eau (env. 1,6 mL). Passer le mélange réactionnel dans une deuxième cartouche d’échange anionique (V19 à V20) pour piéger le produit de4– BF [18F]. Laver le réacteur avec de l’eau (env. 5,5 mL). Passer la solution obtenue par le biais de l’alumine et la deuxième cartouches d’échange anionique. Rincer les seringues S2 et S3 avec de l’eau. Laver la cartouche d’échange anionique deuxième avec de l’eau et sécher avec l’azote gazeux. Éluer le produit (V19 à V20) avec 1 mL de 0,9 % NaCl (V14) en seringue S3. Transférer le produit (400-500 µL) via la ligne de sortie (V21) pour un flacon de verre de 1 mL.Remarque : L’activité molaire est un aspect important de tous traceurs radioactifs. Cependant, sa détermination systématique n’est pas seulement fastidieux mais exige également des quantités significatives de la fraîchement synthétisées [18F] BF4-, tel qu’il devient un facteur limitant pour le nombre d’animaux qui peut être photographiée. Pour tester la reproductibilité et activités molaires de la résultante [18F] BF4–, il est recommandé de planifier quelques essais dédiés à cet effet. Pour plus de détails sur les activités de la molaires, veuillez vous reporter à la section « Discussion ». 4. l’imagerie in vivo de NIS-FP exprimant des cellules par nanoPET/CT Préparation animaux Anesthésier la souris à l’isoflurane de 1,5 à 2,0 % (v/v) dans O2 à un débit de 1,0 à 1,5 L/min dans une chambre à induction. Pour vérifier pour look d’anesthésie suffisante pour absence du réflexe pédale. Faire en sorte de pommade vétérinaire pour animaux yeux à prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie Déplacez la souris sur un bloc de chauffage avec le nez dans un masque d’approvisionnement anesthésique et chauffer la queue (par exemple en plongeant dans l’eau à 37 ° C ou en utilisant une lampe infrarouge). Diluer la solution fraîchement préparée stérile filtrée [18F] BF4– 5 MBq par 50 µL avec du sérum physiologique stérile de 0,9 %. À l’aide d’une seringue reliée à une seringue hypodermique (jauge 29-31), dessiner 100 µL de la solution de4– [18F] BF, mesurer la radioactivité dans la seringue et notez la valeur et le temps de la mesure. Administrer par voie intraveineuse 50 µL de la solution de4– [18F] BF dans la veine caudale préchauffé. Mesurer la radioactivité restante dans la seringue et notez la valeur et le temps de la mesure. La différence entre les valeurs mesurées aux étapes 4.1.7 et 4.1.5 est la dose injectée (ID). Paramétrer une minuterie à rebours de 45 min (heure de commencement du TEP = 0 min). Placez votre souris sur le lit de la nanoPET/tomodensitomètre et vérifier que l’anesthésique est correctement remis en place. Vérifier l’anesthésie reste complet en vérifiant l’absence du réflexe pédale. S’assurer que la souris est positionnée sur le lit de la manière souhaitée, par exemple le « sphinx »-comme position. Installer des dispositifs de surveillance animales conformément aux recommandations du fabricant, par exemple une sonde de température rectale, une sonde de mesure des animaux respirant ou électrodes d’enregistrement des électrocardiogrammes. Vérifier le bon fonctionnement de tous les instruments.Remarque : Pour les tests de spécificité in vivo avec le NIS traceurs radioactifs [18F] BF4–, animaux sont imagés comme décrit ci-dessus et puis reposés éveillé jusqu’à ce que la radioactivité a décru suffisamment pour être considérée comme négligeable, par exemple 48 h plus tard, quand seule 1.3·10−6 % résiduels 18F radioactivité sera présente chez l’animal. À la séance suivante d’imagerie, le substrat compétitif ClO4– est administrée à une dose de 200 mg/kg 30 min avant l’administration de traceurs radioactifs, et l’imagerie est réalisée comme décrit ci-dessus. Imagerie par nanoPET/CT Définir les CT d’imagerie paramètres souhaités, par exemple à l’aide de la tension du tube nanoPET/CT 55 kVp, définir la durée d’exposition à 1200 ms avec un degré angulaire exécution pas à pas et des projections de 180 degrés. Définissez les paramètres d’acquisition d’images de PET. Utilisation statique scan paramètres PET d’une durée de 30 min, 1:5 mode de coïncidence et fenêtre énergie de 400-600 keVp. Lors du compte à rebours = 15 min début d’acquisition d’images CT. Lors du compte à rebours = acquisition d’images de 0 min début PET. Si l’imagerie animale série est requises, laissez les animaux se remettre complètement de l’anesthésie, c’est-à-dire retrouver la conscience sous supervision. Par la suite, transférez-les sur un véhicule d’entretien. Si c’est le terminal d’imagerie session, procéder à l’euthanasie animale en soit surdosage anesthésique, concentration croissante de gaz carbonique ou dislocation du cou. 5. analyse des données in vivo Reconstruire les données de TEP/CT en utilisant un algorithme itératif en 3D basé sur Monte Carlo. S’assurer que les corrections pour l’atténuation, temps mort et décomposition de radio-isotopes sont considérées. Pour détails, reportez-vous aux instructions du fabricant de l’appareil de TEP/CT en cours d’utilisation. Images de cocher CT et PET ne sont correctement enregistrés conjointement et enregistrer les données dans un format d’échange approprié comme « Digital Imaging and Communications in Medicine » (DICOM). Analyser les images Charger les fichiers DICOM reconstruits dans un logiciel d’analyse image approprié qui permet la reconnaissance et la délimitation des régions d’intérêt (ROIs) et quantification de signal PET ultérieure dans ces ROIs. Segmenter la ROIs à l’aide de seuillage manuelle ou adaptative pour définir les ROIs33,34 , à l’aide d’un logiciel adapté. Informations d’image anatomique de la tomodensitométrie aident guide ROI affectation, par exemple les tumeurs superficielles ou volumes pulmonaires. Utilisez le logiciel d’analyse selon les instructions du fabricant et s’assurer que les données sont étalonnées à la dose de radioactivité injectée et corrigées pour l’atténuation et la désintégration radioactive. Dessin graphique montrant les données de cette quantification in vivo . Données explicites que deux pour cent injecté dose/volume (%ID/mL) ou la valeur d’absorption standard (SUV), qui est une mesure alternative compte tenu de la radioactivité dans le corps entier du sujet. Calculer les valeurs de %ID/g en supposant que la densité des tissus à être comme l’eau, c’est-à-dire environ 1 g/L. Il convient de noter que cette hypothèse peut être non valide pour les organes avec des densités sensiblement différentes, tels que les poumons ou les os. Calculer les différents vus pour estimer le véritable SUV (par exemple. SUVmean, SUVmax) ; SUVmax est plus fiable pour les petits objets et est utilisé plus souvent que SUVmean35. 6. ex vivo des analyses Effectuer les analyses énumérées en aval : imagerie de fluorescence (i) des organes contenant fluorescent cancéreux (tumeur primitive et des métastases) au cours de la dissection animale, (ii) la mesure de la distribution tissulaire de traceurs radioactifs et (iii) histologique ou (iv) évaluation de cytométrie de flux des organes cancéreux. Mesure de la distribution de traceurs radioactifs par comptage γ (ex vivo biodistribution) et l’imagerie de fluorescence ex vivo des tissus cancéreux. Mesurant la radioactivité de l’animal entier mort et notez la valeur et le temps. Disséquer les animaux et récolter les tissus suivants : poumon, coeur, sang (à l’aide des capillaires en verre 20 mm), foie, estomac, reins, rate, petits et gros intestins, thyroïde et glandes salivaires, un morceau du muscle de la jambe et les os de l’arrière fémurs, et pertinents et démontable de ganglions lymphatiques et les tissus cancéreux. Mesurer la radioactivité de la carcasse restante, y compris d’abord puis à l’exclusion de la queue et notez les valeurs et les temps de mesure.Remarque : La radioactivité dans la queue peut être considérée comme découlant des traceurs radioactifs qui était mal injecté et donc n’a pas atteint la circulation ; C’est pourquoi, cette quantité de traceurs radioactifs ne contribuait pas à la dose injectée. La radioactivité de la queue sert également un paramètre rétrospectif de la qualité de l’injection. Peser tous les tissus (utiliser des tubes pré-pesés). Prendre des photographies des organes cancéreux en plein jour et sous la lumière de fluorescence.Remarque : Utiliser un support de caméra pour maintenir la distance entre la lentille de la caméra et orgue constante (ou utiliser un instrument commercial dédié à cet effet). Incorporez les organes/tissus destinés à l’histologie en aval en OCT ou immerge-les dans du formol pour la fixation. Pour d’autres applications en aval, préparation de l’échantillon peut différer. Préparer à traceurs radioactifs étalons en double, par exemple 0 à 1000 kBq [18F] BF4–.Remarque : Étalons sont nécessaire pour (i) concernent les coups mesurés par min valeurs de la radioactivité (en kBq) et (ii) simplifier la correction de la carie ; 18 F– peut remplacer [18F] BF4–. Compter la radioactivité de tous les tissus récoltés à l’aide d’un compteur-γ avec les étalons de radioactivité de l’étape 6.1.7. Noter le temps de mesure. Si le taux de comptage sont trop élevés (c’est-à-dire en dehors de la linéarité de l’étalonnage standard ou indiquée par détecteur trop élevé temps morts), re-compter les échantillons deux traceurs radioactifs demi-vies plus tard. Présenter les données sous %ID/g ou valeurs standard d’absorption (SUV) (Equ.2).SUV = (Equ.2) Jeter tous les tissus récoltés qui ne sont pas nécessaires pour approfondir les analyses en aval selon les règles locales de gestion des déchets. Analyser des tissus cancéreux par cytométrie en flux ou histologie selon les préférences de l’utilisateur et la norme de protocoles (comme décrit ailleurs3,6,,28).

Representative Results

La première étape exige que le génie génétique des cellules cancéreuses d’intérêt. Ici, les résultats de la transduction des gènes des cellules de cancer du sein métastatique de 4 t 1 inflammatoire murin et humains cellules MDA-MB-231 métastatiques lentivirus particules transportant l’ADN codant la GFP-NIS ou NIS à la DP sont indiqués. Efficacité de transduction a varié entre les lignées de cellules cancéreuses (Figure 2 a, colonne de gauche). Cependant, toute résultante transduites cellule cancéreuse lignées ont été sélectionnées par FACS à la pureté (Figure 2 a, droite). Microscopie Confocal fluorescence (Figure 2 b) a démontré la localisation correcte des membranes plasmiques de NIS-fonction FPs. NIS-FP a été quantifiée à l’aide de la captation du radiotraceur NIS-offertes (Figure 2-2E) et a démontré la fonction NIS et spécificité. Notamment, aucune différence significative entre 4 t 1. NIS-GFP et 4 t 1. Lignées de cellules exprime NIS-DP avec des niveaux d’expression NIS similaires ont été trouvées (Figure 2). Suite à la caractérisation ligne complète in vitro cell, modèles de tumeur ont été mis en place avec les lignées cellulaires de cancer traçable nouvellement généré. Par exemple, les 4 t 1. Modèle de tumeur de NIS-GFP, un modèle de cancer du sein inflammatoire, est montré ici (Figure 3). En animaux de tumeur-roulement longitudinal confiné TEP a ensuite informé sur la progression des tumeurs dont les métastases (Figure 3 b). Le PET traceurs radioactifs [18F] BF4– était nécessaire pour l’imagerie et fraîchement produite dans la matinée de chaque animal d’imagerie session. Synthèse de [18F] BF4– a été réalisée à l’aide de la méthode décrite d’ARS. En général, ~1.6 GBq 18F– a été utilisé comme entrée et obtenu ~ 244 MBq [18F] BF4– en 40.5±3.9 min (N = 17). Le produit a été analysé par chromatographie sur couche mince de radio ou de la chromatographie ionique et a montré une pureté radiochimique de 94.7±1.4 %. Le rendement radiochimique était de 19.4±4.0 % (carie-corrigé). Le jour 19 après l’inoculation de la tumeur, la tumeur primitive a été clairement identifiée à l’aide de PET, mais ne trouvé aucune métastase. Dix jours plus tard (29), les souris de tumeur-roulement mêmes ont été recréées et les métastases à distance à différents endroits dans tous les animaux (poumon métastase, métastases à divers ganglions inguinale ou axillaires) ont été identifiés. L’exemple de la Figure 3 montre métastase pulmonaire étendue avec plusieurs nodules clairement identifiables et quantifiables dans le poumon (Figure 3 b-3E). En outre, l’animal présenté avec une diffusion régionale de la tumeur dans la paroi péritonéale ainsi que métastase à l’inguinal et les deux ganglions axillaires. Valeurs d’ID % des métastases individuels dans les poumons (Figure 3E) diffèrent considérablement, mais alors ne les volumes occupés des nodules métastatiques sous-jacent. En revanche, les valeurs normalisées volume %ID/mL (Figure 3E) étaient beaucoup plus uniformes. C’était compréhensible pour métastases différents à des stades de développement semblables (c’est-à-dire développé entre 19 et 29 ; Figure 3 b). En revanche, la valeur de %ID/mL normalisée pour la tumeur primitive était inférieure à celui pour les métastases pulmonaires, qui s’inscrit dans une masse de la tumeur qui avait plus de temps pour progresser et remodeler notamment l’afflux d’autres types de cellules (cellules stromales, cellules immunitaires) , en particulier dans ce modèle de cancer du sein inflammatoire. Guidés par des images in vivo et la fluorescence des cellules cancéreuses (visibles au cours de la dissection animale sous la lumière de fluorescence), petits organes profonds tels que les ganglions lymphatiques ont été sûrement récoltés et, en même temps, évalués pour les nodules cancéreux (contenu Figure 4 a). Tandis que le signal de fluorescence au cours de la dissection animale témoignait de la présence de cellules de tumeur, il était important de s’assurer que cette classification a été accompagnée par ex vivo mesures de la radioactivité des tissus récoltés. Figure 4 b montre les valeurs de capture standard (SUV) obtenues pour les différents tissus dans une cohorte de trois animaux, qui a présenté avec métastases. NIS-expression endogène les organes tels que la thyroïde et des glandes salivaires (récoltés combiné) ou l’estomac a également montré la captation du radiotraceur élevés attendus. En outre, cette approche de NIS-FP ont permis l’identification de cellule simple cancer au cours de l’histologie (Figure 4). Ces données d’exemple histologie immunofluorescence ont montré vascularisation tumorale dans les 4 t 1. Modèle de tumeur NIS-GFP. Ces données montrent également que le journaliste de NIS-GFP résidé principalement dans les membranes plasmiques de la tumeur cellules également in vivo (Figure 4), validant ainsi les résultats de l’absorption. Figure 1. Schéma décrivant la mise en place de la plate-forme de synthèse automatisée de traceurs radioactifs pour la production de [18F] BF4– par le biais de la méthode d’ajout de fluor-18-à-bore trifluorure. Les noms de réactif sont imprimés sur les tubes respectifs dans le schéma. L’AMQ est l’abréviation pour échange d’anions d’ammonium quaternaire et indique le matériau utilisé séparation chromatographique en phase solide. Des détails supplémentaires sont disponibles dans les tableaux 1 et 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2. Résultats de caractérisation typique des lignées de cellules cancéreuses exprimant de manière stable GFP-NIS ou NIS-DP. (A) les lignes de la cellule indiquée ont été faites à l’aide de lentivirus transfert GFP-NIS ou NIS-DP. La colonne de gauche montre la population transduite (vert ou rouge fluorescent) contre les cellules parentales respectives (gris ; 4 t 1 et cellules MDA-MB-231, respectivement). Pourcentages montrent des efficacités de transduction tel que déterminé par cytométrie en flux. La colonne de droite montre les résultats de débit par cytométrie en flux analyses après purification des FACS des populations mixtes dans la colonne de gauche. Toutes les lignées cellulaires se sont avérées > 99 % pur pour indiqué les cellules exprimant le NIS (par cytométrie en flux). (B) Microscopie Confocal fluorescence de lignées cellulaires purifiée montre de localisation de la membrane plasmique de GFP-NIS ou NIS-DP dans les lignées cellulaires respectives. WGA-Alexa633 a été utilisé comme marqueur de la membrane plasmique. (C, D) Validation fonctionnelle de protéine de NIS-FP exprimée dans l’indiqué nouvellement généré lignées de cellules cancéreuses. Fonction de NIS a été mesurée à l’aide de traceurs radioactifs des TcO 99 m4– (50 kBq par million de cellules). En tant que contrôles, cellules parentales ont été utilisés ainsi que de cellules exprimant de journaliste fusion qui ont été traités avec le perchlorate de co-substrat NIS avant et Pendant le test (contrôle de la spécificité). Résultats démontrent clairement la fonction de NIS-FP et la spécificité dans toutes les lignées cellulaires. (E) validation fonctionnelle de 4 t 1. Lignées de cellules de NIS-FP en utilisant [18F] BF4– comme un radiotraceur pour NIS. Toutes les autres conditions sont identiques à C. Ce qui est important, l’absorption relative très similaire obtenus pour les deux lignées cellulaires dérivées 4 t 1 avec les deux traceurs radioactifs (Figure 2 et E), ainsi justifiant le recours interchangeable pour in vitro la caractérisation fonctionnelle de Lignées de cellules exprime NIS-FP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. La figure 3. Résultat représentatif de métastases suivi par [18F] BF4–-TEP/CT d’imagerie chez une souris portant un 4 t 1. Tumeur de NIS-GFP. (A) 1 million 4 t 1. NIS-GFP cellules ont été injectées dans les coussinets adipeux mammaires de souris de /CRL. 5-6 semaines BALB/c CanN.Cg-Foxn1nuet la croissance tumorale a été suivie au fil du temps à l’aide d’étriers. En raison de la fluorescence des cellules cancéreuses GFP, évaluation brute d’identification visuelle/croissance a été également possible en utilisant une torche de fluorescence et de verres de filtre approprié (voir encart). (B/gauche) Le jour 19 après tumeur l’inoculation, la tumeur primitive (ligne en pointillé jaune) a été clairement identifiée mais aucune métastase. L’image présentée est une projection de l’intensité maximale (MIP) de l’image de l’animal. Signaux de NIS endogènes (descripteurs blancs) ont également été enregistrées, c’est-à-dire la thyroïde et des glandes salivaires (Th + SG), l’estomac (S) et, à très faibles doses, certaines parties des glandes mammaires et lacrymales. Le signal de la vessie (B) découle de l’excrétion du traceur. (B/droit) Jour 29 après tumeur l’inoculation, métastase a été clairement identifié : multiples métastases dans le poumon (pointillés jaunes), mais aussi les ganglions métastatiques (ILN, AxLN, pointes de flèche jaunes). L’image présentée est un MIP de l’image TEP/CT. La tumeur primitive (ligne en pointillé jaune) ont augmenté non seulement dans une forme globulaire à ce point dans le temps, mais aussi avait envahi dans la paroi péritonéale. (C) une application 3D de la technique de seuillage Otsu activé 3D rendu de surface des tissus cancéreux ; celles-ci sont superposées sur un MIP de PET. Métastases pulmonaires apparaissent en blanches, métastatiques ganglions axillaires en rouge, le ganglion inguinal métastatique en jaune et la tumeur primitive qui ont envahi dans la paroi péritonéale en turquoise. (D) une image de Blow-Up de la MIP TEP/CT à (B/droite) pour indiquer les métastases pulmonaires individuels. (E) captation de traceurs radioactifs dans les tissus cancéreux a été quantifiée à partir d’images 3D (ID %) et normalisée par leurs volumes respectifs (%ID/mL). Métastases pulmonaires individuels correspondent à la numérotation en (ré). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. La figure 4. Exemples typiques de données ex vivo accessibles des souris de tumeur-roulement de NIS-FP. (A) durant tissu récolter des analyses en aval, les propriétés de fluorescence des cellules tumorales exprimant NIS-FP a servi d’indicateur guidant la dissection animale. Comme exemples, les tissus de l’animal dans la Figure 3, c’est-à-dire le poumon avec plusieurs lésions métastatiques et deux ganglions lymphatiques positifs apparaissent. Photographie de lumière du jour ainsie que les images de fluorescence sont affichées. Les images de fluorescence ont été prises avec le même appareil que les images de la lumière du jour mais sous excitation lumineuse bleue (filtre passe-bande de 450±10 nm) avec un filtre vert d’émission (filtre passe-bande de 530±30 nm) placé devant l’objectif de la caméra. (B) Distribution de traceurs radioactifs dans différents organes (« biodistribution ») des animaux avec 4 t 1. Tumeurs de NIS-GFP (N = 3 ; jour 29 après tumeur l’inoculation ; 5 MBq [18F] BF4–). L’absorption standard (SUV) de valeurs ont été calculées et les valeurs > 1 indiquent l’accumulation spécifique des traceurs radioactifs dans les organes respectifs. Les données montrent l’absorption spécifique de traceurs radioactifs dans les tissus cancéreux, c’est-à-dire une tumeur primaire, ganglions métastatiques (tels que définis par l’imagerie et la dissection sous la lumière de fluorescence), poumon (a été disséqué dans son ensemble sans séparer les métastases), ainsi que des organes exprimant endogène NIS, c’est-à-dire thyroïde et les glandes salivaires et l’estomac. Histologie de Immunofluorescence (C) de la tumeur primitive de la même souris tel qu’illustré à la Figure 3. La tumeur primitive a été récoltée, incorporée en OCT et congelée avant d’être sectionnés (10 µm) et transformée pour la coloration. Cellules cancéreuses exprimant de NIS-GFP ont été identifiés directement sans besoin d’anticorps. Les vaisseaux sanguins ont été colorées avec un anticorps de lapin contre souris PECAM-1/CD31 (2 µg/mL) et un anticorps secondaire de chèvre conjugué Cy5 anti-lapin. Les noyaux ont été colorés avec 2′-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) et l’échantillon monté en poly (alcool de vinyle – acétate de vinyle) contenant 2,5 % (p/v) Dabco comme un antifade. Images confocales ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal avec les paramètres appropriés pour 2′-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-Bi-1H-benzimidazole, GFP et Cy5. Ces données montrent clairement que le 4 t 1. Tumeur de NIS-GFP est vascularisé mais aussi cette vascularisation se distingue par son étendue (cf. en haut à gauche avec au milieu en bas). Il montre également que le journaliste de NIS-GFP réside principalement dans les membranes plasmiques de la tumeur des cellules en vivo (en médaillon), validant ainsi les résultats de l’absorption in vitro . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. FASTlab vanne manifold Réactif, solvant, cartouche ou tuyaux * Détails V1 Tube de silicone pour bouteille pour eaux usées [18O] H2O 14 cm V2 0,9 solution de NaCl %, 750 µL flacon de 11 mm V3 Seringue S1 1 mL V4 Cartouche d’échange anionique C1, préalablement conditionnée avec 1 M NaCl (10 mL) et H2O (10 mL) par exemple Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light (eaux, cat. Lol WAT023525) V5 Tube en silicone pour cartouche d’échange anionique C1 14 cm V6 [18O] H2O / réservoir d’entrée18F Max 5 mL V7 Tube en silicone à la cuve du réacteur (côté gauche, entrée de gaz) 14 cm V8 Tube en silicone à la cuve du réacteur (port central ; liquide d’entrée/sortie) 14 cm V9 Fermé V10 Fermé T1S Seringue S2 5 mL V12 15-couronne-5, 46 mg à 800 µL MeCN flacon de 11 mm V13 Trifluoroborate diéthylique éthérate, 0,14 µL dans 850 µL MeCN (diluée 14 µL de BF3. OEt2 avec 1 mL MeCN. Diluer 10 µL de cette solution à 850 µL avec MeCN). flacon de 13 mm V14 0,9 solution de NaCl à %, 1 mL flacon de 13 mm V15 Sac à eau spike V16 Acétonitrile (MeCN), 1,5 mL flacon de 13 mm V17 Tube en silicone pour cartouche neutre d’alumine C2 14 cm V18 Cartouche neutre d’alumine C2, préalablement conditionnée avec H2O (10 mL), l’acétone (10 mL) et l’air (20 mL) par exemple Sep-Pak alumine N Plus Light (eaux, cat. Lol WAT023561) V19 Tube en silicone pour cartouche d’échange anionique C3 14 cm V20 Cartouche d’échange anionique C3, préalablement conditionnée avec 1 M NaCl (10 mL) et H2O (10 mL) par exemple Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light (eaux, cat. Lol WAT023525) T2s Tube en silicone pour flacon 40 cm V22 Fermé V23 Fermé V24 Seringue S3 5 mL V25 Tube en silicone à la cuve du réacteur (droite ; orifice d’aspiration) 40 cm * Remarque : En raison des pointes en plastique, le volume mort pour 11 mm flacons et tubes de 13 mm est environ 0,35 mL et 0,4 mL, respectivement. Par conséquent, les montants effectifs des réactifs transférés vers le réacteur sont légèrement différentes. Toutes les quantités indiquées dans cette méthode se réfèrent aux montants effectifs introduits dans chaque flacon de réactif. Le tableau 1. Description de la mise en page de cassette de synthèse automatisée [18F] BF4– via la méthode d’ajout de fluor-18-à-bore trifluorure (cf. Figure 1). Étapes de la séquence Commentaire [1 – 2] Pressurisez le système et rincer la tubulure avec N2 [3-15] Seringue de rinçage S3 deux fois avec H2O (V15), rincer la tubulure avec N2 [16-23] Pressuriser flacons occupant le V12, V13 et V14, V16, rincer la tubulure avec N2 entre chaque flacon [24-26] Ouvrez l’entrée de l’activité (V6) Relier le flacon contenant 18F. Si le volume total est > 5 mL, seulement insérer l’aiguille à mi-chemin dans le flacon avant de continuer. [27-39] Fermer l’entrée de l’activité (V6), piège 18F en cartouche de l’AMQ C1 (V5), recueillir le [18O] H2O la bouteille pour eaux usées (V1). Si le volume total est > 5 mL, la séquence à étape 37, retour à l’étape 26, pleinement insérer l’aiguille dans le flacon contenant 18F, mettre en pause et reprendre le processus. [40] Fermer la bouteille des déchets [18O] H2O (V1), rincer la tubulure avec N2 [41] Pressuriser le flacon de l’éluant en position V2 [42-44] Ouvrez la valve V8 de réacteur, aspirer l’éluant de V2 dans seringue S1 [45-50] Éluer la cartouche C1 de l’AMQ en réacteur (V8) à l’aide d’une solution saline de seringue S1, régler la température de réacteur à 90 ° C [51] Rincer les cartouches QMA C1 avec N2 et augmentez la température de réacteur à 105 ° C [52-53] Tirer l’acétonitrile V16 seringue S2 [54-57] Transférer l’acétonitrile de seringue S2 dans le réacteur (V8) [58-60] Faire chauffer le réacteur à 120 ° C pendant 5 min s’évaporer le solvant dans un courant de N2 au réacteur (V7). [61-65] Régler la température à 105 ° C, sèche seringue S1 avec N2 [66-69] Tirer la solution 15-couronne-5 V13 seringue S2, augmenter la température du réacteur à 120 ° C [70-71] Réduire la température à 105 ° C, rincer la tubulure avec N2 [72] Refroidir le réacteur (ensemble la température à 40 ° C) pendant 5 min [73-78] Régler la température de réacteur à 80 ° C, transvaser la solution de 15-couronne-5 de seringue S2 dans le réacteur (V8) [79-81] Dessiner le BF3. OEt2 solution de V14 seringue S2 [82-87] Transférer le BF3. OEt2 solution de seringue S2 dans le réacteur (V8), rincer la ligne de réacteur avec N2 [88] Rincer la tubulure avec N2 [89] Réagir pendant 5 min, laissez la température de retour à RT [90-95] Transférer le mélange réactionnel (V8) à seringue S2 [96-104] Passer le mélange réactionnel dans le cartouche d’alumine N C2, seringue S3 [105] Rincer la tubulure avec N2 [106-109] Retourner le mélange réactionnel à seringue S2 [110-112] Vider la seringue S3, tirage H2O (V15) seringue S2 pour diluer le mélange réactionnel [113-115] Charger le mélange réactionnel sur la cartouche de l’AMQ C3 [116-118] Dessiner H2O (V15) seringue S2 [119-124] Rinçage du réacteur (V8) avec H2O de seringue S2, aspirer les lavages de seringue S2 [125-128] Passer les eaux de rinçage sur les cartouches C2 et C3 [129-130] Sécher les cartouches et le collecteur avec N2 [131-136] Seringue de lavage S1 avec H2O (V15) [137-142] Seringue de lavage S2 avec H2O (V15) [143] Rincer la tubulure avec N2 [144-147] Dessiner H2O (V15) seringue S2 [148-151] Rincer les cartouches de l’AMQ C3 avec H2O de seringue S2 [152 et 153] Sécher la cartouche de l’AMQ C3 avec N2 et vider le collecteur avec N2 [154-157] Éluer la cartouche de l’AMQ C3 avec 0,9 % NaCl (V14) seringue S3 [158-161] Transférer le produit de seringue S3 dans le flacon de collection (V21) [162-163] Rincer les cartouches de l’AMQ C3 avec N2 dans le flacon de collection (V21) [164-166] Rincer la tubulure avec N2 [167-170] Rincer les cartouches C2 et C3 (pour bouteille de déchets) et le collecteur avec N2 [171] Rincer la tubulure de la collection (V21) avec N2 Le tableau 2. Description des étapes dans le fichier de séquence XML.

Discussion

La première étape pour rendre le cancer cellules traçable in vivo par cette méthode nécessite d’ingénierie pour exprimer le reporter de fusion de NIS-FP. Le choix de la protéine fluorescente dans le recueil de fusion est critique car oligomerizing protéines fluorescentes peut conduire à la journaliste artificielle mise en cluster, ainsi négativement altération de ses capacités. Nous avons eu des succès avec des protéines fluorescentes monomères éprouvées comme mEGFP (avec la mutation monomerizing A206K³⁶^,³⁷), mTagRFP ou mCherry. NIS peut être de l’homme ou à l’origine de la souris (hNIS ou msNIS) selon le but de l’expérience et le modèle du cancer. Efficacité de la transduction varie généralement entre lignées cellulaires cancéreuses différent. Cependant, lignées cellulaires cancéreuses générées sont ensuite purifiées par FACS dans ce protocole, ce qui réduit la nécessité pour l’optimisation des conditions de transduction. Transduction avec multiplicité élevée de l’infection n’est pas toujours souhaitable que plusieurs construct intégration dans le génome est susceptible d’entraîner non seulement dans l’expression de construction plus élevée, mais aussi en plus indésirables/non réglementée de modification du génome. Par conséquent, il est important de laisser des cellules transduits polyclonales poussent à la stabilité de l’expression (surveillée par cytométrie en flux) et éviter les clones les plus brillants que par FACS de tri. Il restitue également la validation fonctionnelle des fonctions non-journaliste crucial avant que ces cellules doivent être utilisés pour des expériences in vivo . Une alternative développée récemment à la livraison de gènes viraux est gène édition technologie³⁸, qui offre un contrôle plus précis sur les sites d’intégration virale. Analyse de l’expression par cytométrie en flux et immunoblotting est important. Cytométrie en flux permet l’acquisition des données de cellule unique basée sur la population, par exemple pour examiner s’il y a toute dérive dans les niveaux d’expression de journaliste au fil du temps. Elle s’appuie sur la portion FP uniquement, sauf si les cellules sont également colorées avec un anticorps dirigé contre la surface ou total NIS. Cytométrie en flux n’informe pas sur l’intégrité de journaliste de fusion. En revanche, immunoblotting rapports sur l’intégrité de la journaliste de fusion. Le poids moléculaire de NIS et la FP s’ajoutent pour déterminer le poids moléculaire prévu du choisi NIS-FP. Confocal fluorescence microscopie a démontré fusion journaliste co-localisation avec l’agglutinine de germe de blé-la membrane plasmique marqueur dans tous les nouveaux Faites des lignées cellulaires. Ce fut l’emplacement attendu cellulaire pendant la majeure partie de la protéine et indiqué un jalon feu vert pour la validation fonctionnelle subséquente. Si minime/no NIS-FP a été trouvé sur la membrane de plasma (par exemple uniquement dans des compartiments cellulaires internes), ceci indique probablement un problème biologique cellulaire avec le journaliste de fusion dans cette lignée cellulaire ou une mutation potentielle du reporter fusion affectant sa trafic intracellulaire. Il est à noter que nous n’avons pas observé de ce cas dans aucune des cellules cancéreuses nous avons testé à ce jour, qui comprenait : A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (mélanome humain) ; MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (cancer du sein humain) ; NCI-H1975 (cancer du poumon humain) ; SK-Hep1 (cancer du foie humain) ; 4 t. 1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (cancer du sein inflammatoire murin) ; B16F0, B16F3, B16F10 (mélanomes murins) ; MTLn3 (adénocarcinome du sein de rat).

Fonction de NIS doit être mesurée à l’aide de tests d’absorption avec des substrats radioactifs de NIS. En raison de la SPECT radiotraceur ^{99 m}TcO₄^– étant générateur-produit et donc largement disponibles dans les hôpitaux sans la nécessité d’une synthèse de traceurs radioactifs ainsi que d’avoir une demi-vie plus longue plus commode (h 6,01 m ⁹⁹ TC comparativement à 110 min pour ¹⁸F), nous avons utilisé ce substrat de NIS pour validation fonctionnelle systématique de nouvelles lignées de cellules exprime NIS-FP. Avant blocage des cellules exprimant le NIS avec le perchlorate de sodium co-substrat NIS a entraîné la réduction/suppression attendue de la captation du radiotraceur, démontrant ainsi la spécificité de la captation du radiotraceur. Ce test de spécificité de NIS est une étape de validation critique. Si une expérience de spécificité de NIS n’entraînerait pas l’absorption réduite de traceurs radioactifs comparables aux cellules parentales respectives, soit une erreur technique lors de l’expérience s’est produite, ou la captation du radiotraceur n’était pas due à NIS. Il est également possible que sodium perchlorate avant blocage réduit la captation du radiotraceur dans une lignée de cellules parentales ; Cela permettrait d’identifier des lignées cellulaires avec expression endogène de NIS fonctionnelle (p. ex. stimulée thyroïde cellules⁶).

Un avantage crucial du présent protocole d’imagerie, c’est que l’information est recueillie en 3D et au fil du temps. Cela permet la comparaison des images de l’animal même avec le temps, offrant ainsi des données appariées et ainsi surmonter les problèmes causés par les animaux. Cela contraste avec les méthodes d’évaluation plus sans imagerie métastase connexes qui sont inspirent de sacrifier des animaux différents à des moments différents. Dans la Figure 3 b , il est évident comment métastatique propagation et la croissance a progressé au fil du temps dans un animal. Les signaux détectés par imagerie TEP/CT sont fondamentalement causés par l’expression de NIS. Cela inclut tous les signaux de façon exogène les cellules cancéreuses exprimant le NIS ainsi que tous les organes exprimant endogène NIS. Des signaux de NIS endogènes typiques sont trouvent dans la thyroïde et des glandes salivaires, l’estomac et, en faibles quantités dans certaines parties des glandes mammaires et lacrymales. En plus de l’expression endogène de NIS, les traceurs radioactifs [¹⁸F] NIS BF₄^– est également excrétée au niveau des reins, ce qui explique l’absorption traceurs radioactifs dans les vessies rempli d’urine. Absorption de rein n’est plus détectable au point imagerie temps recommandé dans le présent protocole (45 min poste radiotraceur injection⁶). Si les signaux des vessies rempli d’urine devraient conduire à des problèmes de signal-à-fond, la vessie peut être vidée mécaniquement sous anesthésie avant l’imagerie. Ce qui est important, les signaux endogènes peuvent varier entre souches animales. On notera également qu’expression endogène de NIS dans les glandes mammaires peut être plus élevée en vertu de conditions qui n’allaitaient pas¹⁰. Dans le cas présenté et dans les cas de ces lignées de cellules métastatiques caractérisées avec succès avant (cf. liste ci-dessus), nous n’avons pas trouvé expression endogène de NIS considérablement gêner la détection de métastases. Il convient de noter que [¹⁸F] BF₄^– reste plus disponibles pour l’absorption dans les tissus cancéreux comparativement à iodure, parce que l’iodure est métabolisé en hormones thyroïdiennes⁶. Ce phénomène pourrait également contribuer à des quantités plus grandes de radioiodure dans le sang par rapport à [¹⁸F] BF de₄le^{– 6}. Pour différentes applications (cellule cancéreuse suivi dans d’autres cancers ou des cellules non cancéreuses applications de suivi), cela peut être différent, et il est donc recommandé d’évaluer si l’expression endogène de NIS est susceptible d’entraîner des problèmes de signal-à-fond à travers expériences préliminaires. Un aspect important dans l’imagerie préclinique est l’activité molaire du radiotraceur. La méthode décrite ici utilise ~1.5 GBq ¹⁸F^– comme matière départ¹⁴ et a été établie pour produire des molaires activités nettement au-dessus de la méthode de substitution a déjà été indiqué¹². [¹⁸F] BF₄^– dressée à activités molaire ≤ 1 GBq/µmol¹² peut conduire à une absorption réduite dans les tissus exprimant le NIS. Ceci est particulièrement important lorsque la quantité injectée de radioactivité par kilogramme est élevée, c’est-à-dire lorsque les petits animaux comme les souris sont imagés³⁹; Il est moins important chez l’humain mise en⁴⁰. Une activité molaire élevée est donc impérative pour l’imagerie TEP préclinique de haute qualité. Molaires activités obtenues par le bore trifluorure ajout méthode¹⁴, qui s’affiche sous sa forme automatisée dans le présent protocole, surmonter ce problème. En outre, il convient de noter que le protocole présenté pour la synthèse de₄^– [¹⁸F] BF n’est pas conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) et donc impropre à l’usage dans des essais cliniques humains sous cette forme. Un protocole de GMP (via la méthode de substitution de ¹⁸F à radiolabel BF₄^–) est disponible ailleurs⁴⁰.

L’imagerie TEP/CT permet la visualisation de l’absorption de traceurs radioactifs, qui témoigne de l’absorption de traceurs radioactifs NIS-mediated découlant des cellules cancéreuses exprimant de NIS-FP. Plus important encore, les signaux de PET associés peuvent être quantifiés. Il est nécessaire d’appliquer des procédures de seuillage fiable afin d’assurer une différenciation uniforme et impartiale de signaux pertinents provenant de n’importe quel fond potentiel. Car le fond varie dans différents endroits en vivo, il est important de considérer la segmentation et seuillage local/régional. Une de ces méthodes a été développée par baptisé Otsu³⁴et sa mise en oeuvre 3D est utilisée pour le rendu 3D de la tumeur primitive et des métastases dans le présent protocole. Généralement, l’image vue par l’observateur visuellement correspond le mieux aux valeurs quantifiées % injecté dose (ID %). En ce qui concerne la quantification basée sur une image, c’est aussi important normaliser les valeurs de la radioactivité mesurée des différents tissus et volumes. Il existe deux façons utilisés principalement d’exprimer les résultats normalisés, ID d’i % par volume (par exemple %ID/mL) et (ii) norme absorption valeur (SUV,³⁵). Ils diffèrent en ce que %ID/mL prend en compte le volume individuel uniquement, tandis que le SUV est une mesure qui est par rapport à la radioactivité moyenne dans l’ensemble de l’animal entier. Il est également important de noter que l’imagerie NIS rend accessible, le volume de la tumeur direct (LTV) parce que les cellules mortes/mourant ne pas synthèse ATP ne peut plus importer des traceurs radioactifs¹⁰. C’est ce qui explique la grande zone de faible signal au sein de la tumeur primitive (tumeur « en forme de beigne ») en indiquant les domaines de la mort/nécrose des cellules tumorales. Ce qui est important, LTV était une mesure beaucoup plus fiable du fardeau de la tumeur par rapport au volume brut tumeur accessible par des mesures de l’étrier (qui ne tient pas la viabilité compte et évalue les seules régions de tumeur superficielle).

Un avantage majeur de cette stratégie de suivi bi-mode est évident lorsqu’ils pêchent des tissus après abattage animal. Guidés par des images in vivo et secondé par cellules cancéreuses fluorescent au cours de la dissection animale, petites et profondes organes/métastases peuvent aussi être fiable récoltées. Méthodologie de préservation/coupes de tissus congelés permet l’imagerie de fluorescence directe des GFP sans nécessiter de coloration avec un anticorps anti-GFP, mais au détriment de la préservation des tissus structuraux réduite comparativement à fixés au formol méthodologie de paraffine (FFIP). Cette dernière critique nécessite également une coloration anti-FP, car la méthode FFPE est incompatible avec le conservation intacte des protéines fluorescentes (en raison de la fixation/déshydratation/réhydratation). Alors que le signal de fluorescence est révélateur de la présence de cellules de tumeur, il est important de s’assurer que cette classification est confirmée par des mesures de radioactivité ex vivo des tissus récoltés (« biodistribution »). Ex vivo les mesures de la radioactivité sont plus sensibles que la détection visuelle de la fluorescence, peut donc permettre l’identification du cancer des signaux dépendant des lymphocytes qui autrement resteraient inaperçus. Dans le cas d’un terminal d’imagerie session, il est essentiel de noter avec précision les montants à traceurs radioactifs injectés ainsi que les temps des mesures de la radioactivité traceurs radioactifs, injection animale, animaux d’abattage et calibré à scintillation des mesures de tissus récoltés. Cela est crucial pour assurer la correction pour la désintégration des traceurs radioactifs et ainsi permettre une analyse fiable de biodistribution.

TEP/CT d’imagerie active répété non invasif quantification 3D de même que l’évaluation des métastases dans tout l’organisme au niveau de la progression tumorale. Cette fonction est un avantage significatif par rapport aux méthodes conventionnelles, qui reposent souvent sur des cohortes d’animaux qui sont euthanasiés pour l’évaluation de la progression tumorale à différents points dans le temps. Les avantages de cette approche axée sur l’imagerie sont : (i) très sensible non invasif 3D in vivo de quantification, (ii) une réduction significative en nombre d’animaux en raison de la possibilité de répéter imaging, (iii) l’acquisition de données appariées longitudinales d’ultérieures d’imagerie séances d’amélioration des statistiques en excluant la variabilité entre animaux, ce qui réduit davantage le nombre d’animaux, (iv) production automatisée de [¹⁸F] BF₄^– à une activité spécifique élevée et (c) la option intrinsèque ex vivo confirmation dans les tissus par des méthodes de fluorescence telles que la microscopie ou cytométrie en flux.

In vivo des cellules de suivi sont un domaine en pleine croissance. Elle a été alimentée par des avancées récentes en technologie, qui a abouti à une résolution accrue, de limites de détection et de capacité multiplexe (via l’imagerie multimodale) de l’image. Dans ce protocole, nous appliquons ce concept pour suivre la progression des tumeurs dont la métastase cellulaire du cancer spontanée en 3D par imagerie de répéter. Les applications incluent des études visant à éclaircir les mécanismes de la métastase de cellule de cancer spontanée. Par exemple, les cellules de tumeur traçable pourraient être utilisées pour étudier l’impact des composantes différentes cellules immunitaires (comme cadeau/fonctionnelle dans des souches animales de différents niveaux d’immunocompromisation) sur le processus métastatique. De même, l’impact des gènes individuels, soit dans la souche animale ou de la lignée de cellules cancéreuses, pourrait être étudiée. En outre, le protocole présenté pourrait être utilisé pour évaluer/valider l’efficacité des médicaments spécifiques ou des concepts thérapeutiques sur la progression tumorale. Ce qui est important, cette paire de gène : traceurs radioactifs de journaliste pour l’imagerie TEP (NIS : [¹⁸F] BF₄^–) pourraient également être utilisés pour des cellules différentes applications de suivi. Par exemple, plusieurs thérapies cellulaires font leur apparition actuellement des approches thérapeutiques aussi prometteurs. Cela inclut les thérapies cellulaires pour cancer traitement⁴¹ mais aussi dans la transplantation⁴² et⁴⁴ ⁴³^,médecine régénératrice. Corps entier en vivo cellule suivi devient de plus en plus important pour le développement et la traduction clinique des thérapies cellulaires, par exemple, pour l’évaluation de la sécurité et de surveillance de la thérapie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche a été financée par le King College de Londres et UCL complets Cancer Imaging Centre, financé par Cancer Research UK et EPSRC en liaison avec le CFM et le DoH (Angleterre) ; le National Institute for Health Research (NIHR) Centre de recherches biomédicales basé à Guy et St Thomas’ NHS Foundation Trust et College London du King’s ; le Centre d’Excellence en génie médical financé par le Wellcome Trust et EPSRC sous concession numéro WT 088641/Z/09/Z ; Cancer Research UK multidisciplinaire attribution d’un projet à GOF PJB et subvention santé partenaires d’un roi de GOF. Les scanners nanoPET/CT et nanoSPECT/CT ont été achetés et entretenus par une subvention du Wellcome Trust. Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement celles de la NHS, le NIHR ou le DoH.

Materials

Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole	Thermo Scientific	H3570	Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line	ATCC	CRl-2539	for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter	Roche Diagnostics GmbH	5651697001	CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent	Sedna Scientific	2501036
CASYton Isotonic Diluent	Sedna Scientific	2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5	Leica, Wetzlar, Germany		Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness	VWR International	631-0150
Dabco	Sigma	290734	Stock 125 mg/mL
DMEM	Sigma	D5546	Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III	BD Biosciences		Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma	LKB Wallac Laboratory		^99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution	Life Technologies	H1399	1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine	Sigma	G7513	Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells	ATCC	HTB-26	for details see ATCC website
Mowiol 4-88	Sigma	81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP	request from our lab	n/a	For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry	request from our lab	n/a	For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G	Addgene	#12259	plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE	Addgene	#12251	packaging plasmid
pRSV-Rev	Addgene	#12253	packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P43330	Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate)	Polysciences	17951	Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride	Sigma	P8833	From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge	Hettich Lab Technology
RPMI 1640	Sigma	R0883	Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm	Corning
Syringes 10 mL	BD Emerald		Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL	Life Technologies		Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma	59418C	(0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate	Life Technologies	W21404	Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
*Step 2) Establishment of in vivo* tumor models.**
Digital caliper	World Precision Instruments	501601
Isoflurane 1000 mg/g	Isocare		For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin	Terumo		29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [¹⁸F]BF₄^– using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5	Sigma-Aldrich	188832	CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous)	Acros Organics	326811000
Boron trifluoride diethyl etherate	Sigma-Aldrich	216607	BF₃.OEt_2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF₃ basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab	GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes	GE Healthcare		FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets	Macherey-Nagel	802021	RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light	Waters	WAT023525	Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light	Waters	WAT023561	Condition with H₂O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP	GE Healthcare
Nitrogen filter	Millipore	SE2M049I05	Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
*Step 4) In vivo* imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.**
Isoflurane 1000 mg/g	Isocare		For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT	Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber	Vet-Tech	AN010R	With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system	Vet-Tech	AN001B	Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline	Thermo Scientific Oxoid	BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin	Terumo		29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger	Vet-Tech	AN200	VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system
*5) In vivo* data analysis.**
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm	Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software	Invicro LLC., Boston, USA
*6) Ex vivo* analyses**
2-Methylbutane	Sigma	59070-1L-D	Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	85040C
Cover slips 22×50 mm	VWR International	SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT	SLEE Medical		two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson/Stratech	111-175-144	Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco	Sigma	290734	Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35	CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope	Nikon		Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma	LKB Wallac Laboratory		^99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution	Life Technologies	H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter	Electron Microscopy Sciences	SFA-LFS-RBS/GR	Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound	VWR international	361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN	Dako UK Ltd		Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Rabbit anti-CD31	Abcam	ab28364	Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides	VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS)	available from various suppliers.		Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

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Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

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