الجينات مراسل fluorescence النويدات المشعة التصوير لتتبع تطور الورم في نماذج القوارض الورم
Summary
يمكننا وصف بروتوكول لتتبع الإكلينيكية في فيفو من سرطان خبيث. أنه يستند إلى مراسل النويدات مشعة-الأسفار الجمع بين سيمبورتير يوديد الصوديوم، الكشف عنها بواسطة غير الغازية [18و] رباعي فلوروبورات-الحيوانات الأليفة، وبروتين فلوري لتبسيط السابقين فيفو تأكيد. الأسلوب الواجب التطبيق السريري في فيفو خلية تتبع وراء ورم علم الأحياء.
Abstract
ورم خبيث المسؤولة عن معظم وفيات السرطان. وعلى الرغم من البحث المكثف، آليا إلى فهم العمليات المعقدة التي تحكم ورم خبيث لم تكتمل بعد. في فيفو نماذج لها أهمية قصوى لورم خبيث للبحث، ولكن تحتاج إلى صقل. تتبع خبيث عفوية غير الغازية في فيفو التصوير من الممكن الآن، ولكن لا تزال صعبة إذ أنها تقتضي المراقبة منذ فترة طويلة وحساسية عالية. ونحن تصف طولية مجتمعة النويدات المشعة والأسفار جسم كله في فيفو التصوير النهج لتعقب تقدم وتطور ورم خبيث عفوية. وتستخدم هذه المنهجية الجينات مراسل سيمبورتير يوديد الصوديوم (NIS) تنصهر فيها بروتين فلوري (FP). الخلايا السرطانية صممت لصريح ستابلي شيكل-FP متبوعاً بالتحديد استناداً إلى فرز fluorescence تنشيط الخلية. أن يتم إنشاء المقابلة الورم نماذج في الفئران. شيكل إسرائيلي جديد-FP الخلايا السرطانية إذ تعرب عن تعقب غير إينفاسيفيلي في فيفو على مستوى كامل الجسم بالتصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) الدول المستقلة حديثا باستخدام radiotracer [18و] فرنك بلجيكي4–. الحيوانات الأليفة حاليا الأكثر حساسية في فيفو التصوير التكنولوجيا المتاحة في هذا الجدول ويمكن تقدير موثوق بها والمطلق. الأساليب الحالية تعتمد على أفواج كبيرة من الحيوانات التي هي euthanized لتقييم ورم خبيث عند نقاط زمنية مختلفة، أو الاعتماد على تصوير ثنائي الأبعاد بالكاد قابلة للقياس الكمي. مزايا الطريقة الموصوفة: (ط) عالية الحساسية غير الغازية في فيفو تصوير الحيوانات الأليفة 3D والتقدير الكمي، (ثانيا) الحيوانات الأليفة الراسم الإنتاج الآلي، (ثالثا) انخفاض كبير في إعداد الحيوانات المطلوبة بسبب تكرار خيارات التصوير، (رابعا). الحصول على البيانات المزدوجة من الدورات اللاحقة التصوير توفير بيانات إحصائية أفضل، و (v) خيار جوهري السابقين فيفو تأكيدا للخلايا السرطانية في الأنسجة بالأسفار مجهرية أو الخلوي. في هذا البروتوكول، يصف لنا جميع الخطوات المطلوبة من أجل الروتينية شيكل-FP-أتاحت غير الغازية في فيفو سرطان الخلية تتبع استخدام تأكيد PET/CT و السابقين فيفو فيفو في النتائج. هذا البروتوكول له تطبيقات تتجاوز أبحاث السرطان كلما كان في فيفو التعريب والتوسع ورصد منذ فترة طويلة لمحتوى الخلية من الفائدة.
Introduction
المرض المنتشر هو سبب معظم الوفيات الناجمة عن السرطان 1. وعلى الرغم من بحوث مستفيضة في عمليات المنتشر، رصد موثوق بها من سرطان خبيث في نظم نموذجية الحيوان من الصعب تحقيق. وقد مكنت التطورات الحديثة في تقنيات التصوير الجسم كله والنهج التصوير المتعدد الوسائط غير الغازية في فيفو خلية تتبع2،3،،من45. ويمكن استخدام هذا الأخير كأداة رصد وجود وتوزيع، والكمية، والجدوى من الخلايا، غير إينفاسيفيلي ومرارا وتكرارا الحيوانات حية أو من حقوق إنسان.
وغرض الأسلوب الموصوفة هنا طوليا وغير إينفاسيفيلي تتبع الخلايا السرطانية في 3D في نماذج الورم القوارض الحية. باستخدام هذا الأسلوب، سوف تكون قادرة على دقة قياس تطور الورم بما في ذلك انتشار المنتشر في 3D الباحثين. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية غير المستندة إلى التصوير، يقدم هذا الأسلوب الحصول على البيانات الكمية مع إلى حد كبير انخفاض إعداد الحيوانات. ميزة أخرى لهذا الأسلوب أنه يتيح الارتباط في فيفو التصوير مع تحليل مبسط المصب السابقين فيفو المتعقبة خلايا الأنسجة المقطوع بالانسجة أو الخلوي3،6.
وكان الأساس المنطقي لتطوير هذا الأسلوب لتوفير أداة في فيفو للرصد والقياس الكمي لعملية كاملة المنتشر في نماذج القوارض الورم. الأهم من ذلك، وقد صممت للحد من استخدام الحيوانات في الوقت نفسه الحد من تقلب بين الحيوانات. تصوير كامل الجسم غير الغازية الطولي ممتاز مناسبة لإطلاع على ثمرة المنتشر، لهي في حد ذاتها من الصعب التنبؤ بدقة بوقت ومكان حدوثه. ولذلك تم تصوير كامل الجسم ثلاثي الأبعاد في مركز تنمية الأسلوب. حجم الفجوة بين الجسم كله في فيفو تصوير وإمكانات كان المصب السابقين فيفو تأكيد النسيجي، مقياس متعدد النهج التصوير استناداً إلى مراسل النويدات مشعة ذات الوضع المزدوج-الأسفار المعتمدة3، 6.
التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) هي الأكثر حساسية 3D كامل الجسم التصوير التكنولوجيا المتاحة حاليا تقدم ممتاز عمق الاختراق و الكمي المطلق7 مع قرار من < 1 مم8،9. حاليا، يمكن موثوق الإكلينيكية خلية تتبع على مستوى كامل الجسم من النويدات المشعة التصوير الكشف عن الخلايا في كثافة الخلايا ~ 1,000 كل حجم من 1 مليون الخلايا3،6 مع القرارات في المنطقة الفرعية ملليمتر. خلافا مجهرية إينترافيتال، فإنه لا يمكن الكشف عن الخلايا السرطانية نشر واحدة، بل أنها لا تتطلب الإجراءات الجراحية (مثل الدوائر النافذة)، ولا يقتصر مجال رؤية صغيرة، وليس باختراق الأنسجة منخفضة ومبعثر. التصوير الإضاءة الحيوية يوفر بديل غير مكلفة، لكن المقترنة مبعثر والمسائل امتصاص الضوء، فضلا عن ضعف عمق الاختراق، وبالتالي محدودة بشدة في تحديد مقدار2. تصوير كامل الجسم الأسفار وقد استخدمت للحصول على صور ثلاثية الأبعاد، إلا أنها حساسة أقل بكثير مقارنة ب تكنولوجيات الإضاءة الحيوية أو النويدات المشعة2. ومع ذلك، الأسفار يتيح الفرصة لإجراء تحليل السابقين فيفو المصب النسيج الخلوي أو الفحص المجهري. هذا الأخير يغلق المقياس-الفجوة بين تصوير كامل الجسم العيانية (القرار مم) والأسفار الأنسجة المجهرية التحليل (القرار ميكرومتر)3. ولذلك، طرائق النويدات المشعة والأسفار يكمل كل منهما الآخر، بدءاً من مستوى الجسم كله إلى النطاق الخلوية (sub-).
تصوير الجينات مراسل يعتبر مثاليا لفترات طويلة خلية تتبع كما هو مطلوب في أبحاث ورم خبيث. في هذا التطبيق متفوقة على وسم الخلية مباشرة كما هو (ط) لا تتأثر بتمييع التسمية وهكذا لا تقتصر في تتبع الوقت، وتعكس أرقام الخلية الحية (ثانيا) أفضل. ونتيجة لذلك، كامل الجسم خلية تتبع مفيد بشكل خاص للتطبيقات التي يمكن تتبعها الخلايا تتكاثر أو توسيع في فيفو، على سبيل المثال في سرطان البحثية3،6، للكشف عن تشكيل تيراتوما في الجذعية خلية البحث، أو للتحديد الكمي لجهاز المناعة الخليوي توسع5.
مختلف النويدات المشعة على مراسل الجينات هي المتاحة2. وتشمل هذه الإنزيمات مثل كيناز thymidine HSV11 فيروس الحلأ البسيط (HSV1-المعارف التقليدية)، وشركات النقل مثل سيمبورتير يوديد الصوديوم (NIS) أو إفراز الناقل (صافي)، وكذلك مستقبلات الخلية السطحية مثل الدوبامين (مستقبلات D2 D2R). شيكل إسرائيلي جديد هو بروتين عبر غشاء الغليكوزيلاتي الذي يتوسط بنشاط امتصاص يوديد، على سبيل المثال في جرابي خلايا الغدة الدرقية للتوليف اللاحقة لهرمونات الغدة الدرقية10. هذه العملية بدافع سيمبورت نا+ ويعتمد على التدرج الصوديوم الخلوية، الذي تم تطويره من قبل الجمعية الوطنية+/K+-أتباسي11. ونتيجة لذلك، شيكل إسرائيلي جديد يعكس بشكل أفضل المعيشة الخلية عدد من الصحفيين الآخرين كما يرتبط امتصاص يوديد/راديوتراسير نا نشطة+التدرج/K+ بدلاً من مجرد وجود الناقل. تقليديا، وقد استخدم راديويوديدي لتصوير شيكل. تتبع الخلية، وأبلغ راديوتراسيرس شيكل البديلة التي لم يتم تطويق أيضي في الغدة الدرقية لتكون متفوقة6. وهذا مؤخرا بوضع الحيوانات الأليفة radiotracer [18و] رباعي فلوروبورات (فرنك بلجيكي [18و]4–)،من1213 يظهر الدوائية متفوقة بالمقارنة مع راديويوديدي6 بينما يجري متاح في أنشطة محددة ارتفاع14 دون الحاجة إلى مرافق مجمع الكيمياء الإشعاعية. [18و] يمكن توليفها فرنك بلجيكي4– عبر طريقتين مختلفتين. وتستند الطريقة الأولى تبادل النظائر غير مشعة 19و في فرنك بلجيكي4– مع المشعة 18و12. الطريقة الثانية عن طريق إضافة 18و البورون غير مشعة فلوريد ثلاثي14. أفادت الأنباء أن تسفر عن أنشطة محددة ارتفاع14 الأسلوب الأخير وهو الأسلوب المفضل للتصوير السريري.
وأعرب عن شيكل هو الغاية في أنسجة الغدة الدرقية. فهو وارد أيضا في الغدد الثديية اللعابية ولاتشريمال والمرضعات، فضلا عن المعدة، ولكن على مستويات أقل بالمقارنة مع الغدة الدرقية10. ولذلك، يمكن تحقيقها تصوير ممتازة التباين في مناطق أخرى من الجسم باستخدام شيكل. وأيضا كبير مثلى بين الإنسان والفئران والفأر10. وعلاوة على ذلك، لا توجد تقارير السمية عند التعبير شيكل حمل خارج الرحم في الخلايا غير ثيرويدال. الأهم من ذلك، شيكل أيضا لم يكن المقترنة مع الاستجابات المناعية المضيف، لا في البشر ولا في القوارض. وقد استخدمت شيكل كجينات مراسل لقياس المروج النشاط15،،من1617 والجينات التعبير18،19،20،21،22 ،23 في عدة سياقات مختلفة. فقد استخدمت أيضا لتصوير غير الغازية للجينات العلاج ناقلات24،25وتتبع الخلايا في القلب4و المكونة للدم26والتهاب5والدراسات العصبية27. في الآونة الأخيرة، شيكل كما استخدمت كجينات مراسل لتعقب سرطان خبيث في فيفو3،6.
وباختصار، المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب على التقنيات السابقة: (ط) عالية الحساسية غير الغازية 3D في فيفو التعريب والتحديد الكمي المنتشر انتشار، (ثانيا) الإنتاج من [18و] فرنك بلجيكي4– الآلي في أنشطة المولى عالية، (ثالثا) تخفيضاً كبيرا في الحيوانات المطلوبة من خلال التصوير الطولي، (رابعا) الحصول على البيانات المزدوجة من الدورات اللاحقة التصوير أدى إلى تحسين البيانات الإحصائية، مما يقلل بدوره مزيدا من استخدام الحيوانات، و (v) خيار جوهري السابقين فيفو تأكيدا للخلايا السرطانية في الأنسجة بالفحص المجهري الخلوي أو الأسفار.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأولى لتقديم سرطان خلايا يمكن تتبعها في فيفو بهذه الطريقة يتطلب هندسة لهم بالتعبير عن مراسل الانصهار FP شيكل. اختيار بروتين فلوري في المراسل الانصهار الحرجة أوليجوميريزينج البروتينات الفلورية يمكن أن يؤدي إلى مراسل اصطناعية التكتل، مما أضر بوظيفتها. وحققنا نجاحا مع ثبت البروتينات الفلورية أحادي مثل ميجفب (مع أن الطفرة مونوميريزينج A206K،من3637)، أو متاجرفب، أو مشري. شيكل إسرائيلي جديد يمكن أن يكون أما للإنسان أو الماوس الأصل (حنس أو مسنيس) استناداً إلى الغرض من التجربة ونموذج السرطان. توصيل الكفاءة عموما تختلف بين خطوط خلايا السرطان المختلفة. بيد هي تنقية خطوط خلايا السرطان التي تم إنشاؤها في وقت لاحق بنظام مراقبة الأصول الميدانية في هذا البروتوكول، مما يقلل من الحاجة إلى تحسين شروط توصيل. توصيل مع تعدد عالية للإصابة لا ينصح دائماً إدماج بناء متعددة في الجينوم من المرجح أن يؤدي أعلى بنية التعبير ليس فقط ولكن أيضا في تعديل الجينوم المنظم غير المرغوب فيها أكثر. ولذلك، من المهم السماح للخلايا ترانسدوسيد [بولكلونل] ينمو إلى استقرار تعبير (تخضع لمراقبة التدفق الخلوي) وتجنب الفرز المستنسخين ألمع فقط بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. كما يجعل وظيفية التحقق من صحة السمات غير مراسل حاسمة قبل أن تستخدم هذه الخلايا لإجراء تجارب عليها في فيفو . هو بديلاً المطورة حديثا لإيصال المورثات الفيروسية الجينات تحرير التكنولوجيا38، الذي يوفر أكثر تحديداً من السيطرة على مواقع التكامل الفيروسية. من المهم تحليل التعبير بالتدفق الخلوي وإيمونوبلوتينج. التدفق الخلوي يتيح الحصول على البيانات المستندة إلى السكان خلية مفردة، مثلاً، لبحث ما إذا كانت هناك أي الانجراف في مستويات التعبير مراسل على مر الزمن. أنها تعتمد على مجموعة تنظيم الأسرة فقط، ما لم تكن الخلايا ملطخة أيضا بجسم مضاد ضد شيكل السطحية أو مجموع. لا يبلغ التدفق الخلوي بسلامة مراسل الانصهار. وفي المقابل، immunoblotting تقارير بشأن سلامة مراسل الانصهار. الوزن الجزيئي لشيكل، وتنظيم الأسرة يجب أن تضاف إلى تحديد الوزن الجزيئي المتوقعة للمختار FP. شيكل [كنفوكل] الأسفار المجهري أثبتت الانصهار مراسل كولوكاليزيشن مع أجلوتينين جرثومة القمح ماركر غشاء البلازما في جميع حديثا أدلى خطوط الخلايا. هذا الموقع الخلوية المتوقع بالنسبة للبروتين وأشار إلى مرحلة إعدادها للتحقق من صحة الفنية اللاحقة. إذا الحد الأدنى/لا شيكل-FP عثر على غشاء البلازما (مثلاً في المقصورات الداخلية الخلوية فقط)، وهذا يشير إلى مشكلة بيولوجية خلية مع مراسل الانصهار في هذا الخط خلية، أو طفرة محتملة للمراسل الانصهار التي تؤثر على ما الاتجار داخل الخلايا. جدير بالذكر أننا لاحظنا عدم مثل هذه حالة في أي من الخلايا السرطانية وقمنا باختبار حتى الآن، التي تشمل: A375P، A375M2، كورونا-Mel28، WM983A/ب (سرطان الجلد البشري)؛ MCF-7، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-436 (سرطان الثدي)؛ NCI-H1975 (سرطان الرئة البشرية)؛ كورونا-Hep1 (سرطان الكبد البشري)؛ 4T1، 4T1.2، cl 66 4، 67NR، FARN168 (سرطان الثدي التحريضية موريني)؛ B16F0، B16F3، B16F10 (مورين الميلانوما)؛ MTLn3 (فأر غدية الثدي).
يجب أن تقاس الدالة NIS استخدام فحوصات امتصاص مع ركائز شيكل المشعة. نظراً SPECT radiotracer م 99TcO4– التي تنتج المولدات وذلك على نطاق واسع في المستشفيات دون الحاجة إلى أي توليف radiotracer، فضلا عن وجود نصف عمر أطول أكثر ملاءمة (6.01 ح لم 99 Tc بالمقارنة مع 110 دقيقة ل 18و)، استخدمنا هذه الركيزة شيكل للتحقق من الصحة الوظيفية الروتينية خطوط تعرب عن خلية جديدة FP شيكل. قبل تجميد الخلايا معربا عن الدول المستقلة حديثا مع فوق كلورات الصوديوم الركازة المشارك شيكل أسفرت عن التخفيض/إلغاء المتوقعة لامتصاص راديوتراسير، مدللة بذلك على الطابع الخاص لامتصاص راديوتراسير. هذا الاختبار خصوصية شاقل جديد خطوة حاسمة في التحقق من صحة. إذا كان لا يؤدي radiotracer انخفاض الإقبال مقارنة بخلايا الوالدين كل منهما تجربة خصوصية شيكل، حدث خطأ فني خلال التجربة، أو استيعاب radiotracer لم يكن سبب شيكل. من الممكن أيضا أن قبل حظر فوق كلورات الصوديوم يقلل من امتصاص راديوتراسير في خط خلية أبوية؛ هذا سوف تحديد خطوط الخلايا مع التعبير شيكل الفنية الذاتية (مثل الدرقية تحفز الخلايا6).
ميزة حاسمة لهذا البروتوكول التصوير أن يتم جمع المعلومات في 3D ومع مرور الوقت. يسمح هذا المقارنة بين الصور من الحيوان نفسه على مر الزمن، وبالتالي توفير البيانات المقترنة وهكذا التغلب على القضايا الناجمة عن تقلب بين الحيوانات. وهذا يتناقض مع أساليب التقييم المتصلة ورم خبيث-أكثر من التصوير التي تقوم على التضحية بالحيوانات المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. في الشكل 3B من الواضح كيف المنتشر انتشار وثمرة تقدما على مر الزمن في حيوان فردية. أساسا بسبب الإشارات التي تم الكشف عنها بواسطة التصوير PET/CT التعبير شيكل. وهذا يشمل جميع إشارات من خلايا السرطان معربا عن الدول المستقلة حديثا من مناشئ وكذلك جميع أجهزة اندوجينوسلي الإعراب عن الدول المستقلة حديثا. وتوجد إشارات شيكل الذاتية نموذجية في الغدة الدرقية والغدد اللعابية والمعدة، وعند مستويات منخفضة في بعض أجزاء من الغدد الثديية ولاتشريمال. بالإضافة إلى الذاتية شيكل التعبير، يفرز شيكل radiotracer [18و] فرنك بلجيكي4– أيضا عن طريق الكلي، مما يفسر الإقبال راديوتراسير في أكياس مملوءة بالبول. لم يعد الإقبال الكلي يمكن كشفها عند نقطة وقت التصوير الموصى بها في هذا البروتوكول (45 دقيقة بعد راديوتراسير الحقن6). إذا كان ينبغي أن يؤدي إشارات من أكياس مليئة بالبول للإشارة إلى خلفية المسائل، يمكن إفراغ المثانة ميكانيكيا تحت التخدير قبل التصوير. الأهم من ذلك، يمكن أن تختلف هذه الإشارات الذاتية بين السلالات الحيوانية. الجدير بالذكر أن تعبير المؤسسات الوطنية الذاتية في الغدد الثديية يمكن أن تكون أعلى تحت ظروف المرضعات10أيضا. وفي الحالة المعروضة، وفي الحالات هذه الخطوط الخليوي المنتشر تتميز بنجاح قبل (انظر القائمة الواردة أعلاه)، فإننا لم نجد التعبير شيكل الذاتية للتدخل إلى حد كبير في الكشف عن ورم خبيث. جدير بالذكر، أن [18و] فرنك بلجيكي4– ما زالت متاحة أكثر للامتصاص في الأنسجة السرطانية بالمقارنة مع يوديد، لأنه يتم استقلاب يوديد في هرمونات الغدة الدرقية6. هذه الظاهرة قد تسهم أيضا في كميات أكبر من راديويوديدي في مجرى الدم بالمقارنة مع [18و] فرنك بلجيكي4-6. لمختلف التطبيقات (سرطان الخلية تتبع في أمراض السرطان أو الخلايا غير السرطانية تتبع التطبيقات الأخرى)، وهذا قد تختلف، ولذلك يوصي بتقييم ما إذا كانت الذاتية شيكل التعبير من المحتمل أن يسبب مشاكل الإشارة إلى خلفية عن طريق تجارب أولية. جانبا مهما في مجال التصوير السريري هو نشاط المولى راديوتراسير. يستخدم ~1.5 و– جبق 18كانطلاق المواد14 الأسلوب الموصوفة هنا وقد تبين أن إنتاج أنشطة المولى كثيرا أعلاه أسلوب استبدال المبلغ عنها سابقا12. [18و] فرنك بلجيكي4– المنتجة في أنشطة المولى دي وان جبق/µmol12 يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الإقبال في الأنسجة معربا عن الدول المستقلة حديثا. وهذا له أهمية خاصة عند حقن كمية النشاط الإشعاعي للكيلوغرام الواحد ارتفاع، أي عندما تكون الحيوانات الصغيرة مثل الفئران تصويرها39؛ أقل أهمية في الإنسان وضع40. أنشطة المولى عالية ولذلك لا بد لتصوير الحيوانات الأليفة المنتجات عالية الجودة. ضرس الأنشطة التي حصل عليها البورون فلوريد ثلاثي إضافة أسلوب14، الذي يظهر في شكله الآلي في هذا البروتوكول، من التغلب على هذه المشكلة. وعلاوة على ذلك، فمن الجدير بالذكر أن البروتوكول المقدم لتوليف4– فرنك بلجيكي [18و] غير متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) وذلك غير صالحة للاستخدام في التجارب السريرية البشرية في هذا النموذج. بروتوكول برنامج الرصد العالمي (عبر طريقة استبدال 18و راديولابيل فرنك بلجيكي4–) متاح في أماكن أخرى40.
يسمح التصوير PET/CT تصور امتصاص راديوتراسير، مما يدل على استيعاب radiotracer شيكل بوساطة النابعة من الخلايا السرطانية شيكل-FP وإذ تعرب عن. الأهم من ذلك، يمكن قياسها كمياً إشارات الحيوانات الأليفة المرتبطة بها. من الضروري أن تطبق إجراءات العتبة يمكن الاعتماد عليها لضمان تمايز متسقة وغير متحيزة من الإشارات ذات الصلة من أي خلفية محتملة. كما يختلف الخلفية في مواقع مختلفة في فيفو، من المهم النظر في العتبة المحلية والإقليمية، وتجزئة. أحد هذه الأساليب التي وضعتها وسميت أوتسو34، ويعمل في تنفيذه 3D لعرض ثلاثي الأبعاد للورم الرئيسي والانبثاث في هذا البروتوكول. عموما، أن الصورة ينظر المراقب بصريا يناظر أفضل القيم كمياً % حقن جرعة (معرف %). أما بالنسبة للصورة القائمة على القياس الكمي، من المهم أيضا أن تطبيع قيم قياس النشاط الإشعاعي لانسجة مختلفة بأحجامها. هناك طريقتان تستخدم غالباً للتعبير عن نتائج طبيعية، ومعرف (ط) % كل وحدة التخزين (مثل %ID/mL)، وامتصاص (ثانيا) معيار القيمة (35من سيارات الدفع الرباعي). وهي تختلف في ذلك %ID/mL يأخذ في الاعتبار حجم الفردية فقط، بينما سيارات الدفع الرباعي هو تدبير ذو صلة بالنشاط الإشعاعي المتوسط عبر الحيوان كله. من المهم أيضا أن نلاحظ أن تصوير شيكل إسرائيلي جديد يجعل حجم الورم حية (المركبة التكتيكية الخفيفة) موجوداً، لأن الخلايا الميت/الموت لا توليف ATP يمكن لم يعد استيراد راديوتراسير10. وهذا ما يفسر منطقة منخفضة–إشارة كبيرة داخل الورم الرئيسي (“على شكل دونات” ورم) تشير إلى المجالات التي من ورم الخلايا الموت/نخر. الأهم من ذلك، كانت المركبة التكتيكية الخفيفة مقياسا يعول عليه أكثر بكثير من عبء الورم بالمقارنة مع حجم الورم الخام موجوداً بقياسات قدمه ذات الورنيّة (الذي لا يأخذ بعين الاعتبار الجدوى وتقييم المناطق ورم سطحي فقط).
وميزة رئيسية لهذه الاستراتيجية المزدوجة تتبع الواضح عند الحصاد الأنسجة بعد إعدام الحيوانات. تسترشد بالصور في فيفو ومساعدة الخلايا السرطانية الفلورسنت أثناء تشريح الحيوان، يمكن أيضا أن تحصد الأجهزة الصغيرة والعميقة الجذور/الانبثاث موثوق بها. الأنسجة المجمدة تمزيقها/الحفاظ على منهجية تمكن تصوير fluorescence مباشرة للتجارة والنقل دون الحاجة لتلطيخ جسم المضادة-التجارة والنقل، ولكن على حساب الحفاظ على الأنسجة الهيكلية مخفضة بالمقارنة مع الفورمالين–ثابت جزءا لا يتجزأ من البارافين المنهجية (فب). الأخير خطيرة تتطلب أيضا تلطيخ FP المضادة، لأن الأسلوب فب غير متوافق مع الحفاظ عليها سليمة من البروتينات الفلورية (بسبب تثبيت/الجفاف/الإماهة). أن يدل على وجود ورم الخلية إشارة الأسفار، فمن المهم لضمان هذا التصنيف هو ما يؤكده السابقين فيفو قياسات النشاط الإشعاعي للأنسجة المقطوع (‘بيوديستريبوشن’). السابقين فيفو قياسات النشاط الإشعاعي أكثر حساسية من الكشف البصري للأسفار، وبالتالي يمكن أن تسمح بتحديد سرطان الخلية تعتمد على إشارات بخلاف ذلك سوف تبقى غير مكتشفة. في حالة محطة التصوير الدورة، أنه أمر بالغ الأهمية أن نلاحظ دقة المبالغ radiotracer المحقون، فضلا عن أوقات radiotracer قياسات النشاط الإشعاعي، وحقن الحيوان، والحيوان إعدام، ومعايرة قياسات العداد التﻷلؤ الأنسجة المقطوع. وهذا أمر حاسم لضمان تصحيح تسوس راديوتراسير ومن ثم تمكين تحليل موثوق بها بيوديستريبوتيون.
وكرر PET/CT تصوير تمكن الكمي 3D غير الغازية لتطور الورم بما في ذلك تقييم انتشار المنتشر على مستوى كامل الجسم. هذه الميزة هي ميزة هامة على الأساليب التقليدية، التي كثيرا ما تعتمد على أفواج كبيرة من الحيوانات التي هي euthanized لتقييم تطور الورم عند نقاط زمنية مختلفة. مزايا هذا النهج القائم على التصوير: (ط) عالية الحساسية غير الغازية 3D في فيفو الكمي، (ثانيا) انخفاض كبير في إعداد الحيوانات نظراً لإمكانية تكرار التصوير، (ثالثا) الحصول على بيانات مقترن طولية من اللاحقة التصوير دورات تحسين الإحصاءات بالتباين بين الحيوانات، مما يقلل بدوره زيادة إعداد الحيوانات، باستثناء الإنتاج من [18و] فرنك بلجيكي4– الآلي (الرابع) في أنشطة محددة عالية، و (v) الخيار الجوهرية لتأكيد السابقين فيفو في الأنسجة بمنهجيات الأسفار مثل الميكروسكوب أو الخلوي.
في فيفو خلية تتبع حقل متنامية. وقد كانت تغذيها التطورات الأخيرة في تكنولوجيا، مما أسفر عن قرار المعززة وحدود الكشف والقدرة متعدد (عن طريق التصوير المتعدد الوسائط) التصوير. في هذا البروتوكول، نقوم بتطبيق هذا المفهوم لتتبع تطور الورم بما في ذلك السرطان عفوية خلية ورم خبيث في 3D بتكرار التصوير. وتشمل التطبيقات دراسات تهدف إلى كشف آليات الخلية عفوية سرطان خبيث. على سبيل المثال، يمكن الخلايا السرطانية يمكن عزوها دراسة تأثير مكونات الخلايا المناعية المختلفة (كالوقت الحاضر/الوظيفية في السلالات الحيوانية ذات المستويات المختلفة من إيمونوكومبروميسيشن) في عملية المنتشر. وبالمثل، يمكن دراسة تأثير الجينات الفردية، أما في سلالة حيوانية أو خط خلية سرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول المقدم لتقييم/التحقق من فعالية العقاقير محددة أو مفاهيم علاجية على تطور الورم. الأهم من ذلك، هذا الزوج مراسل الجينات: راديوتراسير لتصوير الحيوانات الأليفة (شيكل إسرائيلي جديد: [18و] فرنك بلجيكي4–) يمكن أن تستخدم أيضا لخلية مختلفة تتبع التطبيقات. على سبيل المثال، عدة خلايا العلاجات حاليا الناشئة النهج العلاجية كما تبشر بالخير. وهذا يشمل العلاجات الخلوية ل علاج السرطان41 ولكن أيضا في زرع42 و43،الطب التجديدي44 الإعدادات. الجسم كله في فيفو خلية تتبع تزداد أهمية للتنمية والترجمة السريرية للعلاجات الخلوية، على سبيل المثال، لتقييم سلامة ورصد العلاج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده البحث كلية لندن للملك و UCL المركز الشامل للسرطان التصوير، تموله المملكة المتحدة “لأبحاث السرطان” و EPSRC بالاشتراك مع لجنة نهر الميكونج ووزارة الصحة (إنكلترا)؛ المعهد الوطني للبحوث الصحية (NIHR) “مركز البحوث الطبية الحيوية” في الرجل وسانت توماس دائرة الصحة الوطنية مؤسسة الثقة وكوليدج لندن كينغز؛ مركز الامتياز في “الهندسة الطبية” الممولة من مؤسسة ويلكوم ترست و EPSRC تحت منحة رقم WT 088641/Z/09/Z؛ السرطان بحوث المملكة المتحدة متعددة التخصصات إرساء المشروع لصندوق القناص وبجب، والملك “شركاء الصحة” منحة لصندوق القناص. الماسحات الضوئية نانوبيت/CT ونانوسبيكت/CT تم شراؤها والتي تحتفظ بها على منحة معدات من مؤسسة ويلكوم ترست. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين وليس بالضرورة تلك المستشفيات العامة، وفي NIHR، أو وزارة الصحة.
Materials
| Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
| 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
| 4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
| Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
| CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
| CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
| Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
| Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
| Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
| DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
| FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
| Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
| Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
| pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
| pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
| pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
| Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
| Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
| Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
| SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
| Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
| Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
| Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
| Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
| Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
| Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
| Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
| Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
| Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
| Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
| 15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
| Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
| Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
| Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
| Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
| Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
| Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
| Water for injection USP | GE Healthcare | ||
| Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
| Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
| Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
| Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
| Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
| Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
| Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
| Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
| Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
| Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
| 5) In vivo data analysis. | |||
| Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
| VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
| 6) Ex vivo analyses | |||
| 2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
| Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
| Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
| Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
| Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
| Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
| Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
| Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
| Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
| O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
| Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
| Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
| Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
| Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 | |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54 (2), 167-172 (2013).
- Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55 (4), 686-694 (2014).
- Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52 (20), 1652-1660 (2008).
- Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51 (10), 1637-1643 (2010).
- Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7 (1), 946 (2017).
- Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59 (11), 2727-2746 (2014).
- Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54 (10), 1825-1832 (2013).
- Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40 (5), 744-758 (2013).
- Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35 (1), 106-149 (2014).
- Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24 (1), 48-77 (2003).
- Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (11), 2108-2116 (2010).
- Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32 (2), 98-105 (2011).
- Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6 (1), 34 (2016).
- Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64 (14), 4906-4911 (2004).
- Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47 (5), 854-862 (2006).
- Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30 (5), 748-756 (2003).
- Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69 (6), 2655-2662 (2009).
- Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15 (19), 6079-6086 (2009).
- Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (7), 1377-1385 (2010).
- Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14 (24), 1731-1738 (2007).
- Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8 (1), 16-23 (2006).
- Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192 (1), 279-287 (2009).
- Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8 (3), 508-518 (2003).
- Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18 (4), 312-322 (2007).
- Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
- Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35 (1), 135-145 (2008).
- Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10 (11), 10294-10307 (2016).
- Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 249-257 (2017).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102 (11), 1555-1577 (2010).
- Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31 (6), 496-505 (2010).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163 (2), 257-269 (2003).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25 (2), 173-176 (1998).
- O’Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58 (10), 1666-1671 (2017).
- Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342 (6165), 1432-1433 (2013).
- Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. , (2017).
- Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64 (1), 1-4 (2015).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
