放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

このプロトコルは、イギリス (英国) の法律およびローカル倫理審査パネルで設定のすべての要件を満たしています。次のこのプロトコルを確保するときの手順はまた国の法律およびローカル倫理審査パネルによって決定の要件を満たします。放射能を含むすべての実験は、立法およびローカル ルールに準拠して、安全に行われますを確認します。 1. 工学と放射性核種蛍光融合記者 NIS FP を表現するがん細胞の特性 注: わかりやすくするため、mEGFP A206K は”GFP”、このプロトコルの後続のセクションで「RFP」として mCherry と省略されます。 レンチ ウイルス粒子の生成 レンチ ウイルス粒子を生成する適切なトランスフェクション法を使用して次の 4 プラスミドと共同 293 t 細胞を transfect: (i) レポーター遺伝子をコードしているプラスミド (pLNT 細胞 NIS GFP または pLNT 細胞 NIS RFP (補足情報を参照してください)、(ii)、第 3 世代レンチ ウイルス (iv) ウイルス封筒含むプラスミド、例えば、および (iii) pRSV-Rev、包装プラスミド pRRE pMD2.G。中古トランスフェクション ミックスにそれらを追加する前にプラスミドをミックスします。細胞文化フードのトランスフェクションを実行します。注: 追加のトランスフェクション情報は、補足情報で提供されます。 選択した融合記者 (GFP NIS または NIS RFP) の適切なフィルター設定で標準的な広視野蛍光顕微鏡による 48 時間後トランスフェクションの成功を評価します。注: 蛍光信号がそのためだけにレポーター遺伝子トランスフェクションの示すと成功の共トランスフェクションのサロゲート、成功したウイルス産生の指標ではないです。 注射器を使用してウイルス粒子を含む上澄みを収穫し、0.45 μ m の滅菌ポリエーテルサルホン (PES) フィルターをフィルタ リングによって浮遊細胞および細胞の残骸を削除します。滅菌 1.5 mL ポリプロピレン製反応管に転送します。細胞文化フード ウイルス作業を実行し、ウイルスが含まれている環境を残さないことを確認します。 伝達と NIS FP 発現がん細胞株の選択 混合手順 1.1.3 から純粋な新鮮なウイルス 1:1 (v/v) 最適な培地での各がん細胞株 (MDA MB 231 細胞もどしと 4T1 セル RPMI 1640; メディア構成の材料表を参照してください) を使用します。細胞文化フードの伝達を実行します。注: 一般的なプロトコルの補足情報に呼ばれます。 がん細胞をウイルスを含むを変換 72 h (1 mL またはステップ 1.2.1 からウイルスの混合物の 0.4 mL を使用して 6 ウェルまたは 12 ウェルのスケールの仕事) の 37 ° C で 5% (v/v) CO2を含む加湿雰囲気とインキュベーターの中。 蛍光顕微鏡による対象セル NIS FP 式を監視します。 正常に導入された細胞を標準培養条件 (MDA MB 231 と 4T1 セルラインの ATCC を参照) を使用して 300 万セルのスケールに展開します。 蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用して、非導入細胞から NIS FP 発現細胞を浄化します。注: FACS マイコ プラズマ感染症の原因となることができます。マイコ プラズマ ウイルス産生と FACS 後も伝達や 1.3 のステップの前に確認することをお勧めします。 評価 NIS FP 発現がん細胞 28を他の場所で説明されているように標準フローサイトメトリーによる記者式を確認します。 整合性を確認レポーターに従って標準イムノブロット他29を。 共焦点蛍光顕微鏡による細胞内融合記者ローカリゼーションを分析します。注: 染色や共発現細胞膜マーカー6と後続の共局在解析30のこのステップが促進されます。 NIS FP 発現細胞株のラジオト レーサー摂取量を分析します。注: 既存の機器と互換性がある任意の放射性 NIS 基板は適している、例えばヨウ素同位体 (123私の-、 124私-、 125私-、 131私は-)、 99 mTcO4-、 188ワゴン4-、[18F]、3F-または [18F] BF4-。 シード 106 6 ウェル プレート、最適な培地に細胞を精製した実験 (材料の表を参照) 1 日前。3 通のすべてのサンプルを準備し、コントロールのサンプルが含まれます: (i)「特異性コントロール」、すなわちNIS FP 発現細胞取り込みの特異性; をテストする競争力のある NIS 基板プレインキュベートしました。(ii)「親セル コントロール」、すなわち細胞 NIS FP を表現していないが、親細胞の基底の取り込みをテストするラジオト レーサーを受信。 次の朝に一度無血清培地で細胞を洗浄します。 50 kBq の99 mTcO4-または [18F] BF4- 37 ° C (1 mL 容量) で 30 分の存在下で無血清培地に細胞を孵化させなさい。特異性のコントロール、競争力のある基板 NaClO 報4- (12.5 μ M 最終濃度) で 30 分のセル孵化させなさい済み。競争力のある基質濃度を実験を通じて一定に保つために。 上清を収集し、100 μ L を「上澄み」というラベルの付いた準備コレクション チューブに転送します。 2 回で 1 mL 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 含まれている Ca2 +/Mg2 +細胞を洗浄します。各洗浄ソリューションを収集し、ラベル”wash1″または”wash2″、それぞれ準備のコレクションの管にそれぞれ 100 μ L を転送します。 500 μ L PBS (w/v) の 0.25% トリプシンと 0.53 mM EDTA を含むと細胞を切り離すまでの 37 ° C で培養 (顕微鏡を使用して視覚的にチェック) を追加することによって、細胞を持ち上げます。「セル」というラベルの付いた準備コレクション チューブに懸濁液を転送します。500 μ L 氷冷 PBS 含んでいる Ca2 +/Mg2 +洗浄し、チューブ「セル」に追加します。遠心分離 (250 x g、4 分、4 ° C) によって細胞をペレットします。 選択のラジオ アイソトープからよくガンマ値を使用して各サンプル 4 種類、すべてが適切にカウンター数設定 (ここで: 99 mTc または18F)。注: このアッセイのサンプル数が多いためそれはカウンターを使用する、自動化された γ – 自動減衰補正できる推奨されます。 得られたガンマもあたり総放射能の数を決定する各ウェルからのサンプル数を合計することによってデータを分析します。注: 手順 1.3.4.4 と 1.3.4.5 乗算数によってアカウントに「清」と「洗う」分数の 10 で早かったがかかります。 % 吸収 Equ.1 で示されているように、細胞検査の取り込みを表現します。平均値と帳票の実験からの標準偏差を計算します。(Equ.1)注: ここでは、記者の検証実験について述べ, しかし、非記者関連細胞機能 (例えば増殖、癌細胞の浸潤、遺伝子発現など) は、最終的にアプリケーション固有および各ユーザーの責任。 2.生体内で腫瘍モデルの確立 だけで完全に特徴し、生体内で実験用の細胞を検証を使用します。あらゆる機会に、任意の適切な手法 (例えば蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー) によって投与前に細胞の蛍光を確認します。 5-6 週齢の若い大人の雌マウスの腫瘍モデルを確立します。4T1 腫瘍モデルのうなずくBALB/cAnNCrlまたはBALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (balb/c ヌード) マウスを使用します。Cg Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) MDA MB 231 系腫瘍モデルのマウス。ローカル動物を剃るし、無菌技術を使用します。10 を含む懸濁液 50 μ L を直接注入6 NIS FP 発現がん細胞/mL 4 番目と 5 番目乳首31乳腺脂肪パッドに。注: 注入精度を向上させるのには、(1-2% (v/v) O2) イソフルランなどの吸入麻酔薬を用いた全身麻酔下での注入を実行をお勧めします。注: NIS FP 表現する腫瘍から腫瘍部分の外科的移植腫瘍モデル確立31に代わるアプローチです。 投与後、初期の頃のポスト噴射で注射部位で細胞の蛍光を確認します。蛍光トーチとフィルター メガネ FP に適した選択を使用します。 腫瘍増殖と (特に後時点) での臨床的兆候のチェックを監視します。注: 表在性腫瘍のすなわち同所性乳房腫瘍このプロトコル、使用ノギスと平均腫瘍径 (MTD) の式で = ½·(L + W)32。 3. [18 F] BF 4-自動ルコース合成 (ARS) プラットフォームを使用しての生産。 注: ここでは、三フッ化ホウ素に18F 添加法に基づく自動 [18F] BF4-合成説明です。広く利用可能なアルス プラットフォームのユーザー (材料の表を参照) はこのプラットフォーム (補足ファイル) で自動シーケンスを実行するために必要な対応する拡張マークアップ言語 (XML) ファイルをダウンロードできます。図 1に示すようにカセットのレイアウトの詳細については、XML シーケンス ファイル (テーブル 2) その他の自動化されたプラットホームへの変換をサポートするための各手順の詳細な説明だけでなく、(表 1) で提供されます。 表 1に説明されているようにアルス プラットフォームを設定し、制御コンピューターにロードの正しい XML ファイルで稼働中であることを確認します。アルス プラットフォームは GBq 放射能量と安全作業に適した化学フードに配置されますを確認します。 吸引、サイクロトロン生産 [18F]- F 入口貯水池 (V6) を介して (通常 2-7 mL [18O] H2O で 1.5-2 GBq)。 陰イオン交換樹脂 (例えば第四級アンモニウム アニオン交換カートリッジ; の放射能をトラップします。V4、V5)、回復 [18O] H2O の別のバイアル (V1)。 溶出 [18F] F- (逆溶出、V4、V5) 0.9% (w/v) 食塩 (V2)、750 μ L で反応 (V8) アセトニ トリル (V16) の 1.5 mL に続いて。 105 ° c、5 分の 120 ° C に加熱することによって真空、窒素流下共沸の蒸発によって水を削除します。 80 ° C に原子炉の温度を下げる 無水アセトニ トリル (46 mg、0.21 ミリ モル) で 15-クラウン-5 の 800 μ L を加えるドライ [18F] F-リアクター (V8) の中央のポートを介して。 BF3850 μ L を追加します。OEt の2リアクターに無水アセトニ トリル (0.16 mg、1.13 µmol)。 5 分間室温に戻したしながら反応します。 酸化アルミニウム カートリッジを通って反応混合物を渡す (V17 を v18)、trifluoroborate をトラップします。 反応混合物を注射器 S2 に戻り、(約 1.6 mL) の水で希釈します。 第 2 陰イオン交換カートリッジを通って反応混合物を渡す (V20 に V19) [18F] BF4-製品をトラップします。 (約 5.5 mL) の水で原子炉を洗います。 アルミナと 2 番目の陰イオン交換カートリッジを通して得られた溶液を渡します。 水と注射器は、S2 と S3 をすすいでください。 水で 2 番目の陰イオン交換カートリッジを洗浄し、窒素ガスで乾燥します。 製品の溶出 (V20 に V19) 1 ml の 0.9% の NaCl (V14) にシリンジ S3。 1 mL バイアル コレクションにアウトレット線 (V21) 製品 (400-500 μ L) を転送します。注: 臼歯部の活動はすべて検査の重要な側面です。しかし、その測定は時間がかかるだけでなく、イメージを作成することができます動物の数の制限要因になることも新鮮な合成 [18F] BF4-のかなりの量が必要です。再現性と結果 [18F] のモルの活動をテストする BF4-, この目的のためにいくつかの専用テスト実行をスケジュールするのにはお勧めです。臼歯部の活動の詳細については、議論のセクションを参照してください。 4. nanoPET/CT による細胞のin vivoイメージング NIS FP を表現します。 動物の準備 誘導室 1.0 1.5 L/分の流量で O2 1.5-2.0% (v/v) イソフルレン マウスを麻酔します。ペダル反射の不在のため十分な麻酔の外観を確認します。 麻酔中の乾燥を防ぐために動物の目に獣医軟膏を適用することを確認します。 (例えば37 ° C の水に浸漬または赤外光ランプを使用して) の尾を温かく麻酔供給マスクに鼻で加熱パッドの上にマウスを移動します。 0.9% 生理食塩水 50 μ L あたり 5 MBq に作りたて無菌ろ過 [18F] BF4-ソリューションを希釈します。 注射器を使用して注射針 (計 29-31) に接続されている、[18F] BF4-溶液 100 μ L を描画、注射器、放射能測定、値と測定の時間に注意してください。 静脈内に予め温めておいた尾静脈に [18F] BF4-溶液 50 μ L を管理します。 シリンジの残留放射能を測定し、値と測定の時間に注意してください。4.1.7 と 4.1.5 の手順で測定された値の違いは、注入された線量 (ID) です。 45 分からカウント ダウンするタイマーを設定 (PET 画像診断の開始時間 0 分を =)。 NanoPET/ct のベッドの上にマウスを置き、麻酔供給が正しく再取り付けられていることを確認します。 麻酔がペダルの反射の不在のためにテストすることによって完全なままに確認してください。 マウスが必要なように、例えば「スフィンクス」ベッドの上を確保する-位置のように。 製造元の推奨事項、例えば直腸温度プローブ、動物、呼吸や心電図を記録するための電極を測定プローブによると動物の監視デバイスをインストールします。すべての楽器の適切な機能を確認します。メモ: NIS ラジオト レーサー [18F] BF4-の生体内特異性テストのため動物は前述のように、イメージを作成、放射能はごくわずかと見なされるに十分に減衰するまで、休んで目を覚ましなど48 時間だけ後で 1.3·10− 6% 残留18F 放射能は動物であります。後続のイメージング セッションで競争力のある基板 ClO4-ルコース投与前 30 分の 200 mg/kg の用量で投与し、イメージングが前述のように実行されます。 NanoPET/CT によるイメージング 目的 CT 画像のパラメーターを設定、例えばnanoPET/CT 55 kVp 管電圧を使用して、露光時間を 1 度角度ステップと 180 度予測 1200 ms に設定します。 PET 画像収集用のパラメーターを設定します。静的な使用は、持続時間 30 分、1:5 偶然モードおよび 400-600 keVp エネルギー ウィンドウ ペット パラメーターをスキャンします。 カウント ダウン時間 = 15 分開始 CT 画像の取得。 カウント ダウン時間 = 0 分開始ペット画像集録。 シリアル動物イメージングが必要、動物は完全に監督の下で取り戻す意識すなわち麻酔から回復します。その後、メンテナンス ユニットに転送します。 これはターミナル セッションをイメージングが、どちらの麻酔の過剰摂取、炭酸ガス濃度の上昇や首の脱臼により動物の安楽死に進んでください。 5.体内データ解析 モンテカルロ ベースのフル 3 D 反復アルゴリズムを用いた PET/CT データを再構築します。減衰、デッド ・ タイム、および放射性同位体崩壊の修正が考慮されることを確認します。詳細は、使用の PET/CT 装置の製造元の指示を参照してください。 チェック CT と PET 像が正しく登録されて共同と ‘デジタル画像と通信医学’ など適切な exchange 形式でデータを保存 (DICOM)。 画像を分析します。 認識と関心 (ROIs) とこれらの Roi で後続のペット信号定量化の地域の描写を可能にする適切なイメージ解析ソフトウェアに再建された DICOM ファイルを読み込みます。 ・ ロワ33,34適したソフトウェア パッケージを使用して定義する手動または適応しきい値を使用して Roi をセグメント化します。ガイド投資収益率の割り当てなど表在性腫瘍や肺気量を CT スキャンからの解剖学的画像情報に役立ちます。 製造元の指示に従って解析ソフトウェアを使用してデータが挿入された放射能線量校正および減衰と放射性崩壊の修正を確認します。 描画は、この体内の定量化から表示データをグラフ化します。いずれかのパーセントとして表現データ注入用量/ボリューム (%ID/mL) または代替措置である標準的な摂取量 (SUV)、被写体の全身に放射能を考慮しました。 水、すなわち 〜 1 g/l. のように組織の密度と仮定すると %ID/g 値を計算します。それが、この仮定が大幅に異なる密度、肺や骨などの臓器の無効であることが注目されます。 (E.g真の SUV を推定する別の Suv を計算します。SUVmean、SUVmax);SUVmax は小物より信頼性の高い、SUVmean35よりもより頻繁に使用されます。 6 ex vivo解析。 記載されているダウン ストリーム解析を実行: (i) 動物解剖やルコース組織分布、および (iii) 組織の測定 (ii) (iv) の中に蛍光がん細胞 (原発腫瘍および転移) を含む器官の蛍光癌の臓器のフローサイトメトリー評価。 Γ-カウント (前のヴィヴォ内分) と癌組織のex vivo蛍光イメージングによるルコース分布の測定。 全く死んでいる動物の放射能を測定し、値と時間に注意してください。 動物を解剖し、次の組織を収穫: 肺、心、血 (20 mm のガラス管を使用して)、肝臓、胃、腎臓、脾臓、小腸・大腸、甲状腺、唾液腺、足から筋肉の部分と後部の大腿骨の骨と関連性の高い dissectible のリンパ節、がん組織。 などまず尾を除く残りの死体の放射能を測定し、値と測定の時間に注意してください。注: 尾の放射能と考えられる誤投与、循環に到達しなかった従ってラジオト レーサーに起因したがって、ラジオト レーサーのこの量ない注入量に貢献していた。尾放射能を注入品質の回顧的パラメーターとしても提供しています。 すべての組織 (あらかじめ重量を量られた管を使用) の重量を量る。 日光の下で、蛍光照明の下では、がんの臓器の写真を撮る。注: は、カメラのレンズとオルガンの間の距離を一定に保つ (またはこの目的のための商業の専用器具を使用して) カメラ スタンドを使用します。 臓器・組織 10 月に下流の組織学のためのものを埋め込んだり、ホルマリン固定のためにそれらを浸します。他のダウン ストリーム アプリケーションのサンプル準備は異なる場合があります。 ルコース重複、例えば0 ~ 1000 kBq [18F] BF4-の校正標準器を準備します。注: 校正基準は、(i) (kBq) の放射能値に関連して測定カウント毎分 (ii) 崩壊の訂正を簡略化する必要18F-は、[18F] BF4-を置き換えることができます。 6.1.7 のステップから放射能校正基準とともに γ カウンターを使用してすべての収穫された組織の放射能をカウントします。測定の時間に注意してください。カウント料金が高すぎる場合 (すなわち直線性校正標準または高すぎる検出器によって示されるの外回死んだ)、再サンプル 2 ルコース半減を後でカウントします。 %ID/g または標準的な吸収値 (SUV) (Equ.2) のいずれかのデータを提示します。SUV = (Equ.2) ローカル廃棄物管理規則によるとさらに下流解析の必要はありませんすべての収穫された組織を破棄します。 フローサイトメトリーまたはユーザーの好みや基準に応じて組織による癌組織を分析 (前述の別の場所で3,6,28) のプロトコルします。