Descreveremos um protocolo para pré-clínicos em vivo rastreamento de metástases. É baseado em um repórter de radionuclídeos-fluorescência combinando o symporter de iodeto de sódio, detectado pelo não-invasiva [18F] tetrafluoroborate-animal de estimação e uma proteína fluorescente para confirmação simplificada ex vivo . O método é aplicável para pré-clínicos na vivo celular rastreamento além da biologia do tumor.
Metástase é responsável pela maioria das mortes por cancro. Apesar de inúmeras pesquisas, a compreensão mecanicista dos complexos processos que regem a metástase permanece incompleta. Modelos in vivo são primordiais para a pesquisa de metástase, mas exigem refinamento. Rastreamento de metástases espontânea pelo não-invasivo na vivo imagem agora é possível, mas permanece um desafio que requer observação de longa data e alta sensibilidade. Descrevemos um longitudinal combinada radionuclídeo e fluorescência corpo inteiro na vivo abordagem para controlar a progressão do tumor e metástases espontânea de imagem. Esta metodologia de gene repórter emprega o iodeto de sódio symporter (NIS) fundida a uma proteína fluorescente (FP). As células cancerosas são projetadas para NIS-FP expressa estàvel, seguido de seleção com base na classificação de fluorescência-ativado da pilha. Modelos de tumor correspondentes são estabelecidos em camundongos. NIS-FP expressando as células cancerosas são controladas não invasiva na vivo a nível de todo o organismo, por emissão de positrões (PET) usando o NIS radiotracer [18F] BF4–. Animal de estimação é atualmente o mais sensível na vivo tecnologia disponível nesta escala de imagem e permite a quantificação confiável e absoluta. Métodos atuais dependem de grandes coortes de animais que são sacrificados para avaliação de metástase em diferentes pontos do tempo ou confiam nas imagens 2D quase não quantificáveis. As vantagens do método descrito são: (i) altamente sensível invasivo na vivo 3D PET imaging e quantificação, (ii) automatizada produção traçador de PET, (iii) uma redução significativa no número de animais necessário devido às opções de repetição de imagem, (iv). a aquisição de dados emparelhados de sessões subsequentes de imagem, proporcionando melhor dados estatísticos e (v) a opção intrínseca para confirmação ex vivo de células cancerígenas nos tecidos por microscopia de fluorescência ou citometria. Este protocolo, descreveremos todos os passos necessários para rotina NIS-FP-oferecidas invasivo na vivo câncer celular rastreamento usando PET/CT e ex vivo de confirmação dos resultados na vivo . Este protocolo tem aplicações além da pesquisa sobre o câncer, sempre que na vivo a localização, ampliação e monitoramento de longa data de uma população celular é de interesse.
Doença metastática é a causa para a maioria das mortes relacionadas ao câncer 1. Apesar de inúmeras pesquisas em processos metastáticos, monitoramento confiável de metástases em sistemas modelo animal é difícil de alcançar. Recentes avanços em tecnologias de imagem de corpo inteiro e abordagens de imagiologia multimodais permitiram invasivo na vivo celular rastreamento2,3,4,5. Este último pode ser usado como uma ferramenta para monitorar a presença, distribuição, quantidade e viabilidade de células, de forma não-invasiva e repetidamente em um animal vivo ou um ser humano.
O objetivo do método descrito aqui é para longitudinalmente e de forma não-invasiva acompanhar as células cancerosas em 3D em modelos de tumor roedores vivos. Usando esse método, os pesquisadores será capazes de quantificar com precisão a progressão do tumor incluindo propagação metastática em 3D. Em comparação com as técnicas tradicionais não baseados em imagem latente, este método oferece a aquisição de dados quantitativos com o número de animais em grande parte reduzida. Outra característica desse método é que permite a correlação da imagem latente na vivo com análise simplificada a jusante ex vivo das células controladas em tecidos colhidos por histologia ou citometria de3,6.
A justificativa para o desenvolvimento deste método era fornecer uma ferramenta na vivo para o acompanhamento e a quantificação do processo inteiro metastático em modelos de roedores do tumor. Importante, ele foi projetado para minimizar o uso de animais e, ao mesmo tempo, reduzir a variabilidade de animal para animal. Imagem longitudinal de corpo inteiro invasivo é excelentemente adequada para informar na consequência metastática, para que por si é difícil de prever com precisão o tempo e o local de sua ocorrência. Imagens 3D de todo o corpo, portanto, tem sido o centro de desenvolvimento de um método. Para fechar a lacuna de escala entre todo o corpo na vivo imaging e potencial a jusante ex vivo confirmação histológica, uma abordagem de imagem com base em um repórter radionuclídeo de modo duplo-fluorescência multi-escala foi adotaram3, 6.
Tomografia por emissão de pósitrons (PET) é a mais sensível 3D corpo inteiro imagem tecnologia atualmente disponível, oferecendo excelente profundidade penetração e quantificação absoluta7 com uma resolução de < 1 mm8,9. Atualmente, pré-clínicos celular rastreamento a nível de todo o corpo pela imagem latente do radionuclídeo confiável pode detectar células em densidades de ~ 1.000 células por volume de 1 milhão de células de3,6 com resoluções na região sub milímetros. Ao contrário de microscopia intravital, que não consigo detectar o único espalhar as células cancerosas, mas não requer procedimentos cirúrgicos (por exemplo, câmaras de janela), não está limitado a um pequeno campo de visão e não tecido de baixa penetração e dispersão. Imagens de bioluminescência fornece uma alternativa barata, mas é associada com a dispersão e problemas de absorção da luz, bem como a penetração de profundidade pobre e consequentemente severamente limitada na quantificação2. Imagem de corpo inteiro de fluorescência tem sido utilizada para a aquisição de imagens 3D, mas é muito menos sensível em comparação com bioluminescência ou radionuclídeos tecnologias2. Não obstante, fluorescência oferece a oportunidade de realizar ex vivo tecido a jusante a análise por citometria ou microscopia. O último fecha a diferença de escala entre imagem de corpo inteiro macroscópica (resolução mm) e fluorescência microscópico tecido análise (resolução µm)3. Portanto, radionuclídeos e fluorescência modalidades se complementam, que vão desde o nível de corpo inteiro à escala celular (sub-).
Imagens de gene repórter é ideal para celular prolongada de rastreamento conforme exigido na pesquisa de metástase. Nesta aplicação é superior à célula direta rotulando como é (i) não afetado pela diluição de rótulo e, portanto, não limitado no tempo de acompanhamento e (ii) melhor reflete o número de células vivas. Consequentemente, todo o corpo celular de rastreamento é particularmente útil para aplicações em que células rastreáveis proliferaram ou expandir na vivo, por exemplo, em câncer, pesquisa3,6, para a detecção da formação de teratoma no tronco pesquisa de célula, ou para a quantificação de imune celular expansão5.
Vários genes repórter baseado em radionuclídeos são disponíveis2. Estes incluem enzimas como a herpes simplex vírus HSV11 timidina quinase (HSV1 –tk), transportadores, tais como o iodeto de sódio symporter (NIS) ou o transportador de norepinefrina (NET), bem como receptores de superfície celular como a dopamina D2 receptor ( D2R). NIS é uma proteína trans-membrana glicosilados que medeia activamente a captação de iodeto, por exemplo, em células foliculares na glândula tireoide para a posterior síntese de hormônios da tireoide10. Este processo é conduzido pela symport do at+ e depende do gradiente de celular de sódio, que é mantido pela nd+/k+-ATPase11. Consequentemente, NIS reflecte melhor a vida celular números do que outros repórteres como captação de iodeto/radiotracer está ligada a uma ativo Na+/k+ gradiente ao invés da mera presença do transportador. Tradicionalmente, a radioiodide tem sido usado para a imagem latente de NIS. Para o rastreamento de pilha, radiotracers de NIS alternativos que não são metabolicamente aprisionados na tireoide foram relatados para ser superior6. Este recentemente desenvolvido PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 mostra farmacocinética superior em comparação com radioiodide6 estando disponível em atividades específicas de alto14 , sem a necessidade de instalações complexas de radioquímica. [18-F] BF4– podem ser sintetizados através de duas maneiras diferentes. O primeiro método é baseado na troca de isótopo não-radioativo 19F em BF4– com radioativo 18F12. O segundo método é através da adição de 18F de trifluoreto de boro não-radioativo14. O último método foi relatado para produzir maior actividades específicas14 e é o método de escolha para a imagem latente pré-clínicos.
NIS é altamente expressa em tecidos da tireoide. Também é expressa em glândulas mamárias salivares, lacrimais e lactantes, bem como o estômago, mas em níveis mais baixos em comparação com a glândula tireoide10. Portanto, imagem excelente contraste em outras regiões do corpo pode ser alcançada usando o NIS. É também altamente homólogo entre humanos, rato e do rato10. Além disso, não existem relatos de toxicidade sobre expressão ectópica de NIS em células não-thyroidal. Importante, NIS também não foi associado com o anfitrião respostas imunes, nem em humanos nem em roedores. NIS tem sido usado como um gene repórter, para medir o promotor atividade15,16,17 e gene expressão18,19,20,21,22 ,23 , em vários contextos diferentes. Ele também tem sido usado para tratamento de imagens não-invasivo de terapia de gene a vetores24,25e para rastrear células cardíacas4, hematopoiéticas26, inflamação5e estudos neurais27. Recentemente, NIS também tem sido usado como um gene repórter para rastrear metástases de câncer em vivo3,6.
Em resumo, as principais vantagens deste método sobre técnicas anteriores são: (i) altamente sensível invasivo 3D na vivo localização e quantificação de metastático espalhar, (ii) automatizada produção de [18F] BF4– no atividades de molares alto, (iii) uma redução significativa nos animais necessários através de imagem longitudinal, (iv) a aquisição de dados emparelhados de sessões subsequentes de imagem, resultando em dados estatísticos melhorados, que por sua vez mais reduz o uso de animais e (v) a opção intrínseca para confirmação ex vivo de células cancerígenas nos tecidos por microscopia de fluorescência e citometria.
O primeiro passo para processar câncer células rastreáveis na vivo por esse método requer engenharia-los para expressar o repórter de fusão de NIS-FP. A escolha da proteína fluorescente no repórter de fusão é fundamental como oligomerizing proteínas fluorescentes pode levar a repórter artificial de clustering, afectando assim negativamente a sua função. Tivemos sucesso com comprovada monoméricos proteínas fluorescentes como mEGFP (com a mutação monomerizing A206K36,37), mTagRFP ou mCherry. NIS também pode ser de humanos ou origem do mouse (hNIS ou msNIS), dependendo da finalidade do experimento e o modelo de câncer. Eficiências de transdução geralmente variam entre linhas de células de câncer diferente. No entanto, linhas de células de câncer gerado posteriormente são purificadas por FACS neste protocolo, reduzindo assim a necessidade de otimizar as condições de transdução. Transdução com alta multiplicidade de infecção não é sempre aconselhável, como múltiplos construção integração no genoma é susceptível de resultar não só na expressão de construção mais elevado, mas também na modificação de genoma mais indesejados/não regulamentada. Portanto, é importante deixar polyclonal transduzidas células crescem a estabilidade de expressão (monitorado por citometria de fluxo) e evitar classificar os clones mais brilhantes apenas pela FACS. Ele também processa validação funcional de características não-repórter crucial antes que essas células devem ser usadas para experimentos na vivo . Uma alternativa desenvolvida recentemente para entrega do gene viral é gene edição tecnologia38, que oferece controle mais específico sobre os locais de integração viral. Análise da expressão por citometria de fluxo e immunoblotting é importante. Citometria de fluxo permite a aquisição de dados de base populacional única célula, por exemplo, para examinar se há qualquer deriva em níveis de expressão de repórter ao longo do tempo. Ai vem o moiety FP apenas, a menos que as células também estão manchadas com um anticorpo dirigido contra a superfície ou total NIS. Citometria de fluxo não informa na integridade de repórter de fusão. Em contraste, immunoblotting informa sobre a integridade do repórter fusão. O peso molecular do NIS e o FP deve ser adicionado para determinar o peso molecular esperado do escolhido NIS-FP Confocal fluorescência microscopia demonstrada fusão repórter colocalization com as aglutininas de gérmen de trigo-membrana plasmática marcador em todos os recém feita de linha celular. Este foi o local esperado para a maioria das proteínas celular e indicado um marco go-ahead para posterior validação funcional. Se mínima/no NIS-FP foi encontrado na membrana plasmática (por exemplo, somente em compartimentos celulares internos), isto indicaria uma questão biológica de célula com o repórter de fusão nesta linha de celular, ou uma mutação potencial do repórter fusão afetando sua tráfico intracelular. Vale ressaltar que não temos observado nesse caso em qualquer uma das pilhas de cancer testamos até agora, que incluiu: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (melanoma humano); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (câncer de mama humano); ICN-H1975 (câncer de pulmão humano); SK-Hep1 (câncer de fígado humano); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (câncer de mama inflamatório murino); B16F0, B16F3, B16F10 (melanoma murino); MTLn3 (adenocarcinoma de mama de rato).
Função de NIS deve ser medida utilizando ensaios de absorção com substratos radioactivos do NIS. Devido o SPECT radiotracer 99mTcO4– gerador-produzido e, portanto, amplamente disponível nos hospitais, sem a necessidade de qualquer síntese radiotracer também como tendo uma meia-vida mais longa mais conveniente (6,01 h para 99 m TC em comparação com 110 min para 18F), usamos este substrato de NIS para rotina validação funcional de novas linhas de células expressando de NIS-FP. Pre-bloqueio de células NIS-expressando com o perclorato de sódio NIS co substrato resultou na esperada redução/abolição da captação radiotracer, mostrando assim a especificidade de absorção radiotracer. Este teste de especificidade de NIS é uma etapa crítica de validação. Se um experimento de especificidade de NIS não resultaria na captação reduzida radiotracer comparável às respectivas células parentais, um erro técnico durante o experimento ou a absorção de radiotracer não foi devido ao NIS. Também é possível que o perclorato de sódio pre-bloqueio reduz absorção radiotracer em uma linha da célula parental; Isto identificaria linhas celulares com expressão endógena de NIS funcional (por exemplo, estimulado tireoide células6).
Uma vantagem crucial do presente protocolo de imagem é que informação é recolhida em 3D e ao longo do tempo. Isto permite a comparação de imagens do mesmo animal ao longo do tempo, proporcionando dados emparelhados e, assim, superar os problemas causados pela variabilidade de animal para animal. Isto contrasta com métodos de avaliação de metástase relacionados mais non-imagem latente que se baseiam em sacrificar animais diferentes em pontos diferentes do tempo. Na Figura 3B é evidente como metástase disseminação e consequência progrediram ao longo do tempo em um animal individual. Os sinais detectados por imagens de PET/CT são causados fundamentalmente pela expressão de NIS. Isso inclui todos os sinais de forma exógena NIS-expressando as células cancerosas, assim como todos os órgãos endogenamente expressando NIS. Sinais típicos de NIS endógenos são encontrados na tireoide e glândulas salivares, o estômago e, em níveis baixos em algumas partes das glândulas mamárias e lacrimais. Além de expressão endógena de NIS, NIS radiotracer [18F] BF4– também é excretado através dos rins, assim explicando a captação radiotracer em bexigas cheias de urina. Captação de rim não é mais detectável no ponto de imagem tempo recomendado neste protocolo (45 min post radiotracer injeção6). Se os sinais de bexigas cheias de urina devem conduzir a problemas de sinal-para-plano de fundo, a bexiga pode ser esvaziada mecanicamente sob anestesia antes de imagem. Importante, os sinais endógenos podem variar entre cepas de animais. Também é interessante notar que a expressão endógena de NIS nas glândulas mamárias pode ser mais elevado sob lactantes condições10. No caso apresentado e nos casos dessas linhas de célula metastático caracterizada com sucesso antes (cf. lista acima), não encontramos a expressão endógena de NIS para interferir significativamente com deteção de metástase. Vale ressaltar, que [18F] BF4– permanece mais disponível para captação nos tecidos cancerosos em comparação com o iodeto, porque o iodeto é metabolizado em hormônios tireoidianos6. Este fenômeno também pode contribuir para quantidades maiores de radioiodide na corrente sanguínea em comparação com [18F] BF4– 6. Para diferentes aplicações (acompanhamento em outros cânceres ou células não-cancerosas aplicativos de rastreamento de célula cancerosa), isto pode ser diferente, e, portanto, recomenda-se avaliar se a expressão endógena de NIS é susceptível de causar problemas de sinal-para-fundo através Experimentos preliminares. Um aspecto importante na imagem pré-clínicos é a atividade molar da radiotracer. O método descrito aqui usa ~1.5 GBq 18F– como material inicial14 e foi mostrado para produzir atividades molares significativamente acima o método de substituição anteriormente relatados12. [18-F] BF4– produzido no molar atividades ≤ 1 µmol/GBq12 pode levar a absorção reduzida em NIS-expressando os tecidos. Isto é particularmente importante quando a quantidade injetada de radioatividade por quilograma é alta, ou seja, quando são pequenos animais como ratos, fotografada39; é menos importante no ser humano definindo40. Atividades de alto molares são, portanto, imperativas para a imagem latente PET pré-clínicos de alta qualidade. Atividades molares obtidas por boro trifluoreto adição método14, que é mostrado em sua forma automatizada no presente protocolo, superar esse problema. Além disso, vale ressaltar que o protocolo apresentado para a síntese de4– [18F] BF não é compatível com boas práticas de fabricação (GMP) e, portanto, impróprias para uso em ensaios clínicos humanos neste formulário. Um protocolo de GMP (através do método de substituição de 18F para radiolabel BF4–) está disponível em outros lugares40.
Imagens de PET/CT permite a visualização de captação radiotracer, que é indicativa de absorção mediada por NIS radiotracer decorrentes de células de câncer expressando NIS-FP. Mais importante, os sinais de PET associados podem ser quantificados. É necessário aplicar procedimentos de limiarização confiável para garantir uma diferenciação consistente e imparcial de sinais relevantes de qualquer fundo de potencial. Como o fundo varia em diferentes locais na vivo, é importante levar em consideração a segmentação e limiarização local e regional. Um tal método foi desenvolvido por e nomeado após Otsu34, e sua aplicação 3D é empregada para renderização em 3D do tumor primário e metástases no presente protocolo. Geralmente, a imagem vista pelo observador visualmente melhor corresponda aos valores de dose (% ID) quantificados % injetado. Quanto à quantificação baseada em imagem, é igualmente importante normalizar os valores de medição de radioactividade dos diferentes tecidos para os volumes. Há duas maneiras predominantemente usadas de expressar resultados normalizados, ID de (i) % por volume (por exemplo, %ID/mL) e o valor de (ii) o padrão de captação (SUV35). Eles diferem em que %ID/mL leva em conta o volume individual apenas, enquanto o SUV é uma medida que é relativo a radioatividade média em todo o animal inteiro. Também é importante notar que imagem de NIS processa o volume do tumor ao vivo (LTV) acessível, porque as células morto/morrendo não sintetizar ATP não pode mais importar radiotracer10. Isto explica a grande área de baixo sinal dentro do tumor primário (“em forma de donut” tumor) indicando áreas de tumor de célula morte/necrose. Importante, LTV foi uma medida muito mais confiável do fardo de tumor em comparação com o volume bruto de tumor acessível através de medições de maxila (que não leva em viabilidade de conta e avalia apenas as regiões tumor superficial).
Uma grande vantagem desta estratégia de rastreamento de modo dual é evidente quando a colheita de tecidos após o abate de animais. Guiado por imagens na vivo e assistida por células cancerosas fluorescente durante a dissecção de animais, profundos e pequenos órgãos/metástases pode também ser colhidas confiantemente. Metodologia de preservação/corte de tecido congelado permite que a imagem de fluorescência direta de GFP, sem a necessidade de coloração com um anticorpo anti-GFP, mas em detrimento da preservação de tecido estrutural reduzido em comparação com fixada em formol metodologia de parafina (FFPE). O último criticamente requer também coloração anti-FP, porque o método FFPE é incompatível com preservação intacta de proteínas fluorescentes (devido a fixação/desidratação/reidratação). Enquanto o sinal de fluorescência é indicativo da presença de células do tumor, é importante garantir que essa classificação é confirmada pelo ex vivo medições de radioactividade dos tecidos colhidos (‘biodistribuição’). Ex vivo medições de radioactividade são mais sensíveis de detecção visual de fluorescência, portanto, pode permitir que a identificação do câncer de sinais de celular-dependente que caso contrário permaneceria sem ser detectado. No caso de um terminal sessão de imagem, é fundamental observar com precisão os montantes radiotracer injetado, bem como os horários de medições de radioactividade radiotracer, injeção de animal, animal de abate e calibrado contador de cintilação medições de tecidos colhidos. Isto é crucial para garantir a correção para decaimento radiotracer e desse modo permitir análise biodistribuição confiável.
PET/CT imaging permite repetido quantificação 3D não-invasivo de progressão de tumor, incluindo a avaliação da disseminação metastática em um nível de corpo inteiro. Esta característica é uma vantagem significativa sobre os métodos convencionais, que muitas vezes dependem de grandes coortes de animais que são sacrificados para a avaliação da progressão do tumor em diferentes pontos do tempo. As vantagens desta abordagem baseada em imagem são: (i) altamente sensível invasivo 3D na vivo quantificação, (ii) uma redução significativa no número de animais devido à possibilidade de repetição de imagem, (iii) a aquisição de dados emparelhados longitudinais de subsequentes de imagem sessões de aperfeiçoamento das estatísticas, excluindo a variabilidade de animal para animal, que por sua vez mais reduz o número de animais, (iv) automatizada produção de [18F] BF4– em atividades específicas de alto e (v) a opção intrínseca para ex vivo confirmação nos tecidos por metodologias de fluorescência como microscopia ou citometria.
Na vivo celular de rastreamento é um campo crescente. Ele foi alimentado pelos recentes avanços na tecnologia, o que resultou em maior resolução, limites de detecção e capacidade multiplex (através de imagiologia multimodal) de imagem. Neste protocolo, aplicamos esse conceito para controlar a progressão do tumor incluindo metástases celular espontânea em 3D por repetição de imagem. As aplicações incluem estudos vistos desvendar os mecanismos de metástases celular espontânea. Por exemplo, células tumorais rastreável poderiam ser usadas para estudar o impacto dos componentes de diferentes células imunes (como presente/funcional em cepas de animais de diferentes níveis de immunocompromisation) sobre o processo metastático. Da mesma forma, o impacto dos genes individuais, na estirpe animal ou a linhagem de células de câncer, poderia ser estudado. Além disso, o protocolo apresentado pode ser usado para avaliar/validar a eficácia de medicamentos específicos ou conceitos terapêuticos na progressão do tumor. Importante, este par de gene: radiotracer de repórter para a imagem latente de PET (NIS: [18F] BF4–) também poderia ser usado para aplicativos de rastreamento de célula diferente. Por exemplo, várias terapias celulares atualmente estão surgindo abordagens terapêuticas tão promissoras. Isso inclui celular terapêutica para tratamento de câncer41 , mas também em transplante42 e configurações de44 43,medicina regenerativa. Todo o corpo na vivo celular rastreamento está se tornando cada vez mais importante para o desenvolvimento e a tradução clínica de terapias celulares, por exemplo, para avaliar a segurança e para o monitoramento da terapia.
The authors have nothing to disclose.
A pesquisa foi apoiada pelo faculdade Londres do rei e UCL abrangente câncer Imaging centro, financiado pelo Cancer Research UK e EPSRC em associação com a MRC e DoH (Inglaterra); o Instituto Nacional de saúde pesquisa (NIHR) centro de investigação biomédica com base no tipo e St Thomas’ NHS Foundation Trust e College London do rei; o centro de excelência em engenharia médica de financiado pela Wellcome Trust e EPSRC sob concessão número WT 088641/Z/09/Z; um câncer Research UK multidisciplinar projeto prêmio GOF e PJB e concessão de saúde parceiros do rei a GOF. Os scanners nanoPET/CT e nanoSPECT/CT foram comprados e mantidos por uma doação de equipamentos da Wellcome Trust. As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR ou o DoH.
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |