Мы описываем протокол для отслеживания доклинических в естественных условиях метастазов рака. Он основан на радионуклида флуоресценции репортер, сочетая Симпорт йодида натрия, обнаружены неинвазивные [18F] Тетрафтороборат PET и флуоресцентный белок для подтверждения обтекаемый ex vivo . Метод применим для доклинических в vivo ячейки слежения за пределами биология опухоли.
Метастазирование несет ответственность за большинство случаев смерти от рака. Несмотря на обширные исследования механистического понимания сложных процессов, регулирующих метастазов остается незавершенной. В естественных условиях модели имеют первостепенное значение для исследований метастазов, но требуют доработки. Отслеживание спонтанное метастазов неинвазивные в vivo изображений теперь возможна, но остается сложной, как требует длительного наблюдения и высокую чувствительность. Мы описываем продольной комбинированных радионуклидов и флуоресценции всего тела в vivo imaging подход для отслеживания прогрессии опухоли и спонтанное метастазов. Эта методология гена репортера использует Симпорт йодида натрия (ННГ), сливается с флуоресцентный белок (FP). Раковые клетки предназначены для стабильно Экспресс NIS-FP, после отбора на основе активированного флуоресценции клеток сортировки. Соответствующие модели опухоли, установлены в мышей. NIS-FP, выражая раковые клетки считано неинвазивно в естественных условиях на уровне всего тела, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с помощью NIS радиоиндикаторных [18F] BF4–. ПЭТ в настоящее время является наиболее чувствительным в vivo imaging технологии, доступные в этом масштабе и дает надежные и абсолютной количественной оценки. Текущие методы полагаются на большой когорты животных, которые умерщвлено для оценки метастазов в различные моменты времени, или полагаться на едва количественному 2D изображения. Преимущества метода описаны являются: (i) высокочувствительный неинвазивные в vivo 3D PET изображений и количественной оценки, (ii) автоматизированные производства ПЭТ трассирующими, значительное сокращение числа требуемых животных из-за повторных изображений вариантов, (iii) (iv). приобретение парных данных из последующих сессий изображений, обеспечивая лучше статистические данные и (v) параметр встроенные ex vivo подтверждения раковых клеток в тканях микроскопии флуоресцирования или цитометрии. В этом протоколе мы опишем все шаги, необходимые для обычной NIS-FP-предоставлена неинвазивные в vivo рак клеток отслеживания с помощью ПЭТ/КТ и ex vivo подтверждения результатов в естественных условиях . Этот протокол имеет приложений за пределами онкологии, всякий раз, когда в vivo локализации, расширение и давним мониторинг популяции клеток представляет интерес.
Метастатической болезни является причиной большинства связанных с раком смерти 1. Несмотря на обширные исследования в метастатических процессов надежный мониторинг метастазов рака в животной модели систем трудно достичь. Последние достижения в технологии визуализации всего тела и мульти-модальных изображений подходы позволили неинвазивные в vivo ячейки отслеживания2,3,4,5. Последний может использоваться как инструмент для мониторинга присутствия, распределение, количество и жизнеспособность клеток, неинвазивно и неоднократно в живое животное или человека.
Цель метода, описанного здесь является продольно и неинвазивным отслеживать раковые клетки в 3D в живых грызунов опухоли модели. С помощью этого метода, исследователи смогут точно подсчитать прогрессии опухоли, включая распространение метастазов в 3D. По сравнению с традиционными методами на основе изображений, этот метод предлагает приобретение количественных данных с главным образом сокращением поголовья. Еще одной особенностью этого метода является, она позволяет корреляции в vivo изображений с обтекаемый течению ex vivo анализ гусеничных клеток в тканях заготовленной на гистологию или цитометрии3,6.
Основанием для разработки этого метода было предоставить в vivo инструмент для мониторинга и количественной оценки всей метастатического процесса в модели грызунов опухоли. Важно то, что он был разработан, чтобы свести к минимуму использование животных в то же время снижение изменчивости между животных. Продольные неинвазивной визуализации всего тела отлично подходит для информирования о метастатическим нарост, для которых само по себе это трудно точно предсказать время и место его возникновения. 3D визуализация всего тела поэтому был в центре разработки метода. Чтобы закрыть масштаб разрыва между всего тела в vivo изображений и потенциал, которые течению ex vivo гистологического подтверждения, многомасштабный изображений подход, основанный на двухрежимные радионуклидов флуоресценции репортер был принят3, 6.
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является наиболее чувствительных тела изображений технологии 3D имеющихся в настоящее время, предлагая отличную глубину проникновения и абсолютной количественная оценка7 с разрешением < 1 мм8,9. В настоящее время доклинические ячейки отслеживания на уровне всего тела с радионуклидной визуализации может надежного выявления клеток при плотностях ~ 1000 ячеек на объем миллиона клеток6 3,с резолюциями в регионе Подкомиссии миллиметр. В отличие от прижизненной микроскопии он не может обнаружить одно распространение раковых клеток, но она не требует хирургических процедур (например , окно камеры), не ограничена, небольшое поле зрения, а не низкой ткани проникновения и разброс. Биолюминесценции изображений предоставляет недорогой альтернативой, но ассоциируется с рассеяния и поглощения света вопросы, а также бедных глубина проникновения и в квантификации2серьезно ограничены вследствие. Флуоресценции всего тела изображения была использована для приобретения 3D изображения, но это намного менее чувствителен, по сравнению с биолюминесценции или радионуклидных технологий2. Тем не менее флуоресценции предлагает возможность анализа ex vivo течению ткани цитометрии или микроскопии. Последний закрывает масштаба разрыв между макроскопического тела изображений (разрешение мм) и флуоресценции микроскопические ткани анализ (резолюция мкм)3. Таким образом радионуклидов и флуоресценции механизмы дополняют друг друга, начиная с уровня всего тела к шкале сотовой (суб-).
Репортер ген изображений идеально подходит для длительного ячейки отслеживания необходимости в исследованиях метастазов. В этом приложении он превосходит прямой клеток маркировки как это (i) не влияет на этикетке разрежения и таким образом не ограничивается в отслеживания времени и (ii) лучше отражает число живых клеток. Следовательно особенно полезно для приложений, в которых прослеживается клетки размножаются или расширить в естественных условиях, например в рак исследований3,6, для обнаружения тератома формирования в стволовых клеток тела отслеживания клетки исследование, или для количественной оценки иммунных клеток расширения5.
Различных радионуклидов основе репортер гены являются доступны2. К ним относятся ферментов, таких как герпес симплекс вирус HSV11 Тимидинкиназа (HSV1 –ТЗ), конвейеры таких Симпорт йодида натрия (NIS) или норадреналина транспортера (нетто), а также поверхности рецепторы клеток как допамин (рецептор D2 D2R). НИС – гликозилированного транс мембранный белок, который активно опосредует поглощение йодида, например в фолликулярных клеток щитовидной железы для последующего синтеза гормонов щитовидной железы10. Этот процесс управляется symport Na+ и опирается на клеточном натрия градиента, который поддерживается Na+/k+-АТФазы11. Следовательно, NIS лучше отражает живые клетки чем другие журналисты, как поглощение йодида/радиоиндикаторных связано с активной Na+/k+ градиент, а не простое присутствие транспортера. Традиционно, используется radioiodide для NIS воображения. Для отслеживания ячейки, Улучшенный6сообщалось альтернативные radiotracers NIS, которые не являются метаболически захваченного в щитовидной железе. Это недавно разработанных Тетрафтороборат PET радиоиндикаторных [18F] ([18F] BF4–)12,13 показывает превосходное фармакокинетики по сравнению с radioiodide6 во время доступна на14 высоких конкретных мероприятий без необходимости использования сложных радиохимии зал. [18F] – BF4может быть синтезирован через двумя различными способами. Первый метод основан на изотопного обмена нерадиоактивные 19F в BF4– с радиоактивными 18F12. Второй способ — через дополнение 18F нерадиоактивные бора трифторид14. Последний метод было сообщено доходность выше конкретных мероприятий14 и является методом выбора для доклинических воображения.
NIS высоко выражается в тканях щитовидной железы. Это выражается также в слюнных, слезных и кормящих молочных желез, а также желудка, но на более низком уровне по сравнению с щитовидной железы10. Таким образом отличную контрастность изображений в других регионах тела может быть достигнуто с помощью службы NIS. Это также весьма гомологичных между человеком, крысы и мыши10. Кроме того Есть никаких сообщений о токсичности после внематочной NIS выражение в не тороидальной клетках. Важно отметить, что NIS также не был связан с принимающей иммунные реакции, ни людей, ни грызунов. ННГ был использован как репортер ген для измерения промоутер деятельности15,16,17 и ген выражение18,19,20,21,22 23 ,в нескольких разных контекстах. Он также был использован для неинвазивной визуализации генной терапии векторов24,25и отслеживать клетки в сердечной4, кроветворные26, воспаление5и нейронных исследований27. Недавно НИС также использовалась как репортер ген для отслеживания метастазов рака в естественных условиях3,6.
Таким образом, основными преимуществами данного метода за предыдущие методы являются: (i) высокочувствительный неинвазивные 3D в vivo локализации и количественной оценки метастатического распространения, (ii) автоматизированное производство [18F] BF4– в Высокая молярная деятельность, (iii) значительное снижение требуется животных через продольной томографии, (iv) получение парных данных из последующих сессий изображений, что приводит к улучшению статистических данных, которые в свою очередь еще больше снижает использование животных и (v) встроенный вариант для ex vivo подтверждения раковых клеток в тканях, цитометрии или флуоресцентной микроскопии.
Первый шаг для визуализации рака клеток прослеживается в естественных условиях этим методом требует инженерных их выразить репортер фьюжн NIS-FP. Выбор флуоресцентный белок в Фьюжн репортер имеет решающее значение, как oligomerizing флуоресцентных белков может привести к искусственным репортер кластеризации, тем самым негативно сказывается на его функцию. Мы имели успех с проверенной мономерных флуоресцентных белков, таких как mEGFP (с monomerizing мутации A206K36,37), mTagRFP или mCherry. NIS может быть либо человека или мыши происхождения (hNIS или msNIS) в зависимости от цели эксперимента и модель рака. Трансдукция эффективности обычно варьируются между различными рак клеточных линий. Однако сгенерированный рак клеточных линий впоследствии очищаются от СУИМ в этот протокол, тем самым снижая потребность в оптимизации условий трансдукции. Трансдукция с высокой кратности инфекции не всегда является целесообразным как несколько конструкцию интеграции в геном может привести не только в более высоких конструкция выражения, но и в более нежелательных/нерегулируемые модификации генома. Таким образом важно позволить поликлональными transduced клетки растут стабильность экспрессии (контролируется проточной цитометрии) и избежать сортировки ярких клонов только по СУИМ. Она также оказывает функциональные проверки характеристик-репортер решающее значение до того, как эти клетки должны использоваться для экспериментов в естественных условиях . Недавно разработанные альтернативой вирусных генов доставки является ген редактирования технологии38, которая предлагает более конкретные контроль над вирусный интеграции сайтов. Анализ выражения проточной цитометрии и immunoblotting имеет важное значение. Проточной цитометрии позволяет приобретать на основе населения одной ячейки данных, например выяснить есть ли любой дрейф в уровнях выражения репортер с течением времени. Он опирается на общие FP только, если клетки также витражи с антитела, направленные против поверхности или всего NIS. Проточной цитометрии не информировать о целостности репортер фьюжн. В противоположность этому immunoblotting сообщает о целостности репортер фьюжн. Молекулярная масса ННГ и FP должен быть добавлен к недавно определить ожидаемые молекулярная масса выбранной NIS-FP. конфокальная флуоресценции микроскопии продемонстрировал фьюжн репортер colocalization с плазматической мембране маркер зародышей пшеницы агглютининов во всех сделал клеточных линий. Это был ожидаемый сотовой местоположение для большинства белка и указала идти вперед вехой для последующей функциональной проверки. Если минимальный/нет NIS-FP была найдена на плазматической мембраны (например только в сотовой внутренних отсеков), это будет указывать на ячейку биологических проблему с репортером фьюжн в этой линии клетки, или потенциальные мутация репортер слияние затрагивающих его внутриклеточные людьми. Примечательно, что мы не наблюдали такого дела в любой из раковых клеток, мы протестировали так далеко, которые включали: A375P, A375M2, СК-Mel28, WM983A/B (человека меланомы); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (рак молочной железы человека); NCI-H1975 (рак легких человека); SK-Hep1 (человека рак печени); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (мышиных воспалительного рака молочной железы); B16F0, B16F3, B16F10 (мышиных меланомы); MTLn3 (Крыса молочной железы аденокарцинома).
NIS функция должна быть измерена с помощью поглощения анализов с радиоактивными NIS субстратов. Из-за ОФЭКТ радиоиндикаторных 99 mТШО4– , генератор производства и поэтому широко доступны в больницах без необходимости для любого радиоиндикаторных синтеза, а также иметь более удобный длительный период полувыведения (6.01 h для 99 m TC по сравнению с 110 мин 18F), мы использовали этот субстрат NIS для обычной функциональной проверки новых ШЕКЕЛЕЙ-FP выражая клеточных линий. Предварительное блокирование NIS-выражая клеток с перхлората натрия NIS совместно субстрата привело ожидаемого сокращения/abolishment радиоиндикаторных поглощения, продемонстрировав тем самым специфики радиоиндикаторных поглощения. Этот тест специфика NIS является критической проверки шаг. Если эксперимент специфика NIS не приведет снижение радиоиндикаторных поглощение сопоставимых в соответствующие родительские клетки, либо произошла техническая ошибка во время эксперимента, или поглощение радиоиндикаторных не обусловлено NIS. Это также возможно, что перхлората натрия предварительно блокирование уменьшает поглощение радиоиндикаторных в родительских клеток линии; Это определит клеточных линий с эндогенного функциональных выражение NIS (например стимулировали щитовидной железы клетки6).
Решающим преимуществом этой визуализации протокола является, что информация собирается в 3D и с течением времени. Это позволяет сравнения изображений из же животное во времени, тем самым обеспечивая парных данных и таким образом преодолеть проблемы, вызванные между животных изменчивости. Это контрастирует с методы оценки связанной с метастазами самых не изображений, которые основаны на жертву различных животных в разных временных точках. В рисунке 3B является очевидным распространение как метастатических и нарост прогрессировала с течением времени в отдельных животных. Сигналы обнаружены ПЭТ/КТ принципиально вызваны NIS выражения. Это включает в себя все сигналы от экзогенно NIS-выражая раковые клетки, а также все органы эндогенно выражая NIS. Типичный эндогенного NIS сигналов находятся в щитовидной железы и слюнные железы, желудка и, на низком уровне в некоторых частях молочной и слезных желез. Помимо эндогенного выражение NIS NIS радиоиндикаторных [18F] BF4– также экскретируется через почки, таким образом объясняя радиоиндикаторных поглощения в моче заполнены пузыри. Почки поглощение больше не обнаруживаемая в изображений момент времени, рекомендуется в настоящем Протоколе (45 мин пост радиоиндикаторных инъекций6). Если сигналы от мочи заполнены пузыри должны привести к проблемам с сигнала к фон, мочевого пузыря может быть механически пустым под анестезией до изображений. Важно отметить, что эндогенного сигналов может варьироваться от животных штаммов. Примечательно также, что эндогенного NIS выражение в молочных желез может быть выше при кормящих условия10. В представленном случае и в случаях тех метастатического клеточных линий, успешно характеризуется прежде чем (см. перечень выше) мы не нашли эндогенного NIS выражение существенно мешать обнаружения метастазов. Примечательно, что [18F] BF4– остается более доступными для поглощения в раковой ткани по сравнению с йодидом, потому что йодида метаболизируется в6гормонов щитовидной железы. Это явление может также способствовать большее количество radioiodide в потоке крови по сравнению с [18F] BF4– 6. Для различных приложений (раковых клеток, отслеживания в других раковых заболеваний или не раковая клетка отслеживания приложений) это может отличаться, и поэтому рекомендуется оценить ли эндогенного NIS выражение может вызвать вопросы сигнала к фон через Предварительные эксперименты. Важным аспектом в доклинических изображений является Молярная деятельность радиоиндикаторных. Метод, описанный здесь использует ~1.5 GBq 18F– в качестве отправной материала14 и было показано производить Молярная деятельности значительно выше метод сообщалось ранее замены12. [18F] BF4– производится на Молярная деятельности ≤1 ГБк/мкмоль12 может привести к снижение поглощения в NIS-выражая тканях. Это имеет особое значение при высокой вводят количество радиоактивности на килограмм, т.е. когда небольших животных, таких как мыши образы39; в человека, установка40менее важно. Поэтому Высокая молярная мероприятия необходимо для высокого качества доклинические PET изображений. Молярная деятельности получено бора фторид дополнение метод14, который показан на его автоматизированной форме в настоящем Протоколе, преодолеть эту проблему. Кроме того, стоит отметить, что представленный протокол [18F] BF4– синтеза не является совместимым с хорошей производственной практики (GMP) и поэтому непригодными для использования в человеческих клинических испытаний в этой форме. GMP протокол (через метод подстановки 18F для radiolabel BF4–) доступен в другом месте40.
ПЭТ/КТ позволяет визуализировать радиоиндикаторных поглощения излучения, которое свидетельствует о NIS-опосредованной радиоиндикаторных поглощения, вытекающих из NIS-FP, выражая раковых клеток. Что еще более важно связанные PET сигналы могут быть количественно. Это необходимо применять надежные Бинаризация процедуры для обеспечения последовательной и объективной разграничения соответствующих сигналов от любых потенциальных фона. Как фон колеблется в различных местах в естественных условиях, важно учитывать местные и региональные ограничивание и сегментации. Один такой метод был разработан и назван Оцу34, и ее осуществление 3D используется для 3D-рендеринга первичной опухоли и метастазов в настоящем Протоколе. Как правило изображение, видимое наблюдателем визуально лучше всего соответствует значениям дозы (% ID) количественных % инъекции. Что касается количественной оценки на основе образов также важно нормализовать значения измерения радиоактивности различных тканей для их объемы. Выражением нормализованные результаты, (i) % ID тома (например , %ID/mL), и (ii) стандартная поглощение значение (35внедорожник) преимущественно используется двумя способами. Они отличаются тем, что %ID/mL принимает во внимание отдельные тома только, в то время как внедорожник является мерой, которая является относительно средний радиоактивности через весь животного. Важно также отметить, что NIS изображений делает живой опухоли тома (LTV) доступны, потому что мертвых/смерти клетки, которые не синтеза АТФ может больше не импортирует радиоиндикаторных10. Это объясняет большую площадь сигнала в рамках первичной опухоли (опухоли «образный пончик») указанием областей смерти/некроз клеток опухоли. Главное LTV был гораздо более надежной мерой бремя опухоли по сравнению с сырой опухоли объем доступной измерениями суппорта (которая не принимает во внимание жизнеспособности и оценивает только поверхностные опухоли регионов).
Основным преимуществом этой стратегии двойного режима отслеживания очевидна, когда заготовка тканей после выбраковки животных. Руководствуясь в vivo изображения и помогали флуоресцентные раковые клетки во время животных рассечение, малые и глубоко укоренившиеся органов/метастазов также могут быть надежно собраны. Замороженные ткани сохранение/секционирование методология позволяет прямой флуоресценции изображений GFP без необходимости для пятнать антитела анти GFP, но за счет сохранения сокращение структурных тканей по сравнению с формалином исправлено парафин врезанных методология (FFPE). Последний критически требует также анти FP окрашивание, потому что метод FFPE несовместима с нетронутыми сохранение флуоресцентных белков (из-за фиксации обезвоживания для регидратации). В то время как флуоресценции сигнал свидетельствует о присутствии клеток опухоли, важно, чтобы убедиться, что эта классификация подтверждается ex vivo измерения радиоактивности собранного тканей («накопление»). Ex vivo измерения радиоактивности более чувствительны, чем визуального обнаружения флуоресценции, поэтому может позволить выявление рака клеток зависит от сигналов, которые в противном случае останется незамеченным. В случае изображений сессии терминал очень важно точно отметить вводят радиоиндикаторных суммы, а также времена радиоиндикаторных измерения радиоактивности, животных инъекции, забой животных и калиброванные измерения сцинтилляционных счетчиков Собранный тканей. Это крайне важно для обеспечения коррекции для радиоиндикаторных распада и тем самым обеспечить надежный накопление анализа.
ПЭТ/КТ изображений позволяет повторять неинвазивные 3D количественную оценку опухолевой прогрессии, включая оценку метастатическим распространения на уровне всего тела. Эта функция является существенное преимущество перед традиционными методами, которые часто опираются на большой когорты животных, которые умерщвлено для оценки опухолевой прогрессии в различные моменты времени. Преимущества этого подхода на основе изображений являются: (i) высокочувствительный неинвазивные 3D в vivo количественной оценки, (ii) значительное снижение поголовья благодаря возможности повторить изображений, (iii) на приобретение продольных данных парных от последующих изображений сессий, совершенствования статистики путем исключения между животных изменчивость, которая в свою очередь еще больше снижает поголовья, (iv) автоматизированное производство [18F] BF4– на высоких конкретных мероприятий и (v) встроенный вариант для ex vivo подтверждения в тканях флуоресценции методологиями микроскопии или цитометрии.
В естественных условиях клетки отслеживания является развивающейся области. Он был вызван недавние выдвижения в технологии, что привело к расширенной резолюции, пределы обнаружения и мультиплексной возможности (через мультимодального imaging) визуализации. В этом протоколе мы применяем эту концепцию для отслеживания прогрессии опухоли, включая спонтанного рака клеток метастазов в 3D повторных изображений. Приложения включают исследования, направленные на распутывая механизмы спонтанного рака клеток метастазов. Например прослеживается опухолевые клетки могут использоваться для изучения влияния различных иммунных клеток компонентов (как подарок/функциональные животных штаммов различных уровней immunocompromisation) на метастатического процесса. Аналогично можно было бы изучить влияние отдельных генов, в животных штамм или линии клеток рака. Кроме того представленные протокол может использоваться для оценки и проверки эффективности конкретных наркотиков или терапевтические концепции прогрессии опухоли. Важно отметить, что эта пара генов: радиоиндикаторных репортер для PET изображений (ННГ: [18F] BF4–) также могут быть использованы для различных клеток, отслеживания приложений. Например несколько клеточной терапии в настоящее время формируются как многообещающие терапевтические подходы. Это включает в себя клеточной терапии для лечения рака41 , но и в трансплантации42 и44 параметры регенеративной медицины43,. Всего тела в vivo ячейки отслеживания становится все более важным для развития и клинический перевод клеточной терапии, например, для оценки безопасности и мониторинга терапии.
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано короля колледже Лондона и UCL всеобъемлющей Imaging центр рака, финансируемых исследований рака Великобритании и EPSRC совместно с MRC и DoH (Англия); Национальный институт медицинских исследований (NIHR) биомедицинских научно-исследовательский центр, основанный на парня и Сент-Томас NHS Фонд доверия и лондонском Королевском колледже; Центр передового опыта в медицинской техники, финансируемых Уэллком траст и EPSRC Грант номер WT 088641/Z/09/Z; Рак исследований Великобритании многодисциплинарного проекта награда GOF и PJB и король партнеров в области здравоохранения грант для GOF. NanoPET/и nanoSPECT/Карата сканеры были приобретены и поддерживается оборудования грант от Уэллком траст. Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR или DoH.
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |