Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin

O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII₂)¹. NADH e DANIII₂ são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O₂) no complexo IV¹. A termodinamicamente favorável “ladeira abaixo” transferência de elétrons para O₂ no final da cadeia é acoplada à exportação de prótons para o intermembrane espaço pelos complexos I, III e IV. Isso cria um gradiente eletroquímico transmembrana de prótons (força motriz protónica), uma forma temporária de energia livre de Gibbs que é aproveitada pelo complexo V tornar ATP². Reações de transferência de elétrons nas mitocôndrias não são perfeitamente acopladas a produção de ATP. Em vários pontos do ciclo de Krebs e a cadeia respiratória, elétrons prematuramente podem interagir com O₂ para formar ROS³. ROS mais biologicamente relevante gerado por mitocôndrias são O₂^{● –} e H₂O₂. Embora O₂^{● –} é muitas vezes considerado o ROS proximal formado por mitocôndrias, agora é evidente que sites de produção formam uma mistura de O₂^{● –} e H₂O₂, que é associado com o livre química radical de flavin prótese grupos^4,5. Em níveis elevados, ROS pode ser perigoso, danificando componentes biológicos necessários para a função celular, resultando em angústia oxidativo⁶. No entanto, em quantidades reduzidas, ROS mitocondriais cumprir funções de sinalização vitais. Por exemplo, lançamento de H₂O₂ de mitocôndrias tem sido implicado no controle da ativação de células T, sinalização de stress (por exemplo, indução de vias de sinalização Nrf2), a indução da proliferação celular e diferenciação, sinalização da insulina e liberação e alimentação comportamento⁷. Progresso considerável tem sido feito na compreensão da função de sinalização de ROS. No entanto, importantes questões ainda permanecem em relação à qual enzimas nas mitocôndrias servem como as fontes mais importantes e como a produção é controlada.

Lançamento ROS por um site de produção depende de vários fatores: 1) a concentração da doação de elétrons do site, 2) o estado redox do site doar elétrons, 3) acesso ao oxigênio e 4) a concentração e tipo de substrato de oxidação^{3, 8 , 9}. nas mitocôndrias, outros fatores como a concentração de NADH e membrana potencial força também influenciam a produção de ROS^8,10. Por exemplo, a taxa de O₂^●-/ h₂O₂ produção purificada PDHC ou KGDHC aumenta com NADH crescente disponibilidade de^5,11. Nesse cenário, os elétrons estão fluindo para trás do NADH ao centro FAD na subunidade₃ E PDHC ou KGDHC, o site para O₂^●-/ h₂O₂ produção¹². Da mesma forma, a prestação de NAD⁺ tem o efeito contrário, diminuindo a liberação ROS de KGDHC¹². Assim, controlando a entrada e a saída de elétrons a partir de sites de produção de ROS pode alterar quanto₂●/h₂O₂ é formado. Por exemplo, bloqueando a subunidade₂ E PDHC ou KGDHC com CPI-613, um ácido lipoico analógico, o que resulta em uma quase 90% diminuição₂●/h₂O₂ produção¹³. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o químico S-glutathionylation catalisadores, diamido e dissulfiram, que quase abolir O₂^●-/ h₂O₂ produção pelo PDHC ou KGDHC através da conjugação de glutationa para o E ₂ subunidade¹⁴. O trade-off para bloquear o fluxo de elétrons através da subunidade₂ E PDHC e KGDHC é uma diminuição na produção de NADH, que diminui a formação de ROS por cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, complexo III). Isto também pode diminuir a produção de ATP pela cadeia de transporte de elétrons. Em geral, bloqueando a entrada do elétron aos locais de produção de ROS pode ser um meio altamente eficaz de controlar O₂^●-/ h₂O₂ produção.

As mitocôndrias podem conter até 12 potencial O₂^●-/ h₂O₂ fontes⁶. A maioria destes sites são flavin-contendo enzimas que geram uma mistura de O₂^{● –} e H₂O₂. Utilização de substrato diferente e combinações do inibidor permitiram a identificação dos quais complexos respiratórios e desidrogenases mitocondriais servem como O de alta capacidade₂^●-/ h₂O₂ formando sites em diferentes tecidos³. PDHC e KGDHC foram mostrados para servir como alta capacidade₂●/h₂O₂ sites emitindo no músculo e fígado mitocôndrias^13,15. No entanto, algumas dificuldades permanecem no que se refere a análise do₂●/h₂O₂ formando potenciais de sites individuais em mitocôndrias e o impacto que combinações de inibidor e substrato diferente em a atividade das enzimas. Isto é devido à presença de reações colaterais indesejáveis (por exemplo, formação de₂●/h₂O₂ por sites que não sejam a enzima de interesse), contaminando nutrientes endógenos (por exemplo,graxos ácidos) ou organelas (por exemplo,, peroxissomos que também formam O₂^●-/ h₂O₂) e uso de inibidores que a falta de seletividade, e/ou uso de compostos que não inibir totalmente a produção de ROS. Certos inibidores podem também alterar a bioenergética mitocondrial e a direção do fluxo de elétrons, e isto altera a liberação ROS de outros sites de produção e confunde os resultados. Preços absolutos para O₂●/h₂O₂ liberação de sites individuais nas mitocôndrias também são difíceis de quantificar devido à alta concentração de O₂^{● –} e H₂O₂ eliminando as enzimas no espaço matriz e intermembrane. Portanto, a eliminação de reações concorrentes que possam interferir com O₂^●-/ h₂O₂ lançamento medições pode ser útil quando identificando O de alta capacidade₂^●-/ h₂O₂ formando sites.

Aqui, apresentamos um método simples que permite a análise simultânea de O₂^●-/ h₂O₂ produção e formação de NADH por purificada desidrogenases dependentes de flavin. Usando enzimas purificadas, indesejados ROS formando reações colaterais e ROS enzimas degradantes podem ser eliminadas permitindo uma medida mais precisa do nativo O₂^●-/ h₂O₂ taxas de produção para flavoenzymes individual. Esse método pode ser usado para comparar diretamente os₂●/h₂O₂ formando a capacidade de diferentes desidrogenases purificadas ou aos potenciais inibidores específicos do site de tela para O₂^●-/ h₂O versão ₂ . Finalmente, medir₂●/h₂O₂ e a produção de NADH simultaneamente pode permitir uma avaliação em tempo real da relação entre a atividade enzimática e a capacidade de liberação ROS.