Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

Het uiteindelijke doel van nutriënten metabolisme is dat adenosinetrifosfaat (ATP). In de cellen van zoogdieren, dit gebeurt in de mitochondriën, dubbel-membraned organellen die de energie opgeslagen in koolstof in ATP omzetten. De productie van ATP begint wanneer koolstof is verbrand door de mitochondriën vormen twee elektron luchtvaartmaatschappijen, NADH en flavine adenine dinucleotide (FADH₂)¹. NADH en FADH₂ worden vervolgens geoxideerd door multi subeenheid respiratoire complexen I en II, respectievelijk, en de bevrijde elektronen zijn overgezet naar de terminal elektron acceptor moleculaire zuurstof (O₂) bij complexe IV¹. De thermodynamisch gunstige “afdaling” overdracht van elektronen aan O₂ aan het einde van de keten is gekoppeld aan de export van protonen in de intermembrane ruimte door complexen I, III en IV. Hierdoor ontstaat een transmembraan elektrochemische gradiënt van protonen (proton-motor), een tijdelijke vorm van Gibbs vrije energie die wordt onttrokken door complexe V om ATP²te brengen. Electron transfer reacties in mitochondriën zijn niet perfect gekoppeld aan de ATP productie. Op verschillende punten in de citroenzuurcyclus en de luchtwegen keten, kunnen elektronen voortijdig communiceren met O₂ aan formulier ROS³. Het meest biologisch relevante ROS gegenereerd door mitochondriën zijn O₂^●- en H₂O₂. Hoewel O₂^{● –} wordt vaak beschouwd als de proximale ROS gevormd door mitochondriën, is het nu duidelijk dat sites van productie een mengsel van O₂^●- en H₂O_{2 vormen}, die is gekoppeld aan het vrije verkeer radicale chemie van flavin prothetische groepen^4,5. Op een hoog niveau kunnen ROS gevaarlijke, schadelijke biologische bestanddelen die nodig zijn voor cel functie wat resulteert in oxidatieve nood⁶. Echter bij lage bedragen vervullen mitochondriale ROS signalering lichaamsfuncties. Bijvoorbeeld heeft H₂O₂ vrijlating uit de mitochondriën betrokken bij de controle van T-cel activatie, stress signalering (b.v., inductie van Nrf2 signaalroutes), de inductie van celproliferatie en differentiatie, insuline signalering en versie en voeding gedrag⁷. Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het begrip van de signalering functie van ROS. Echter belangrijke vragen blijven met betrekking tot die enzymen in mitochondriën dienen als de belangrijkste bronnen en hoe de productie wordt gecontroleerd.

ROS vrijlating door een plaats van productie is afhankelijk van verschillende factoren: 1) de concentratie van het doneren van de elektron site, 2) de redox staat van de elektron doneren site, 3) toegang tot zuurstof, en 4) de concentratie en het type van oxidatie substraat,^{3, 8 , 9}. in de mitochondriën, andere factoren zoals ook invloed op de concentratie van NADH en membraan potentiële kracht ROS productie^8,10. Bijvoorbeeld, het tarief van O₂^{● –}/H₂O₂ productie door gezuiverde PDHC of KGDHC neemt toe met toenemende NADH beschikbaarheid-^5,11. In dit scenario stromen elektronen achteruit van NADH naar het midden van de FAD in de E-₃ subeenheid van PDHC of KGDHC, de site voor^{O₂● –}/H₂O₂ productie¹². Ook heeft de levering van NAD⁺ het tegenovergestelde effect, afnemende ROS vrijlating uit KGDHC¹². Zo kunt controlerende binnenkomen of verlaten van elektronen van sites van ROS productie wijzigen^{hoeveel O₂● –}/H₂O₂ wordt gevormd. Bijvoorbeeld, het blokkeren van de E-₂ subeenheid van PDHC of KGDHC met de CPI-613, een analoge, resulteert in een bijna 90% afname van O₂^{● –}/H₂O₂ productie¹³liponzuur. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met de chemische S-glutathionylation katalysatoren, diamide en disulfiram, die bijna af te O₂^{● –}/H₂O₂ productie door PDHC of KGDHC via de vervoeging van glutathion tot en met de E schaffen ₂ subeenheid¹⁴. De trade-off voor het blokkeren van de elektronen stromen door de E-₂ subeenheid van PDHC en KGDHC is een afname van de productie van NADH die ROS vorming door het elektronentransport keten (bijvoorbeeldcomplexe III vermindert). Dit kan door de keten elektronentransport ATP-uitvoer vertragen. Blokkeren van elektron toegang tot sites van ROS productie kunnen over het algemeen een zeer effectief middel O₂^{● –}/H₂O₂ productie te controleren.

Mitochondriën kunnen maximaal 12 potentiële O₂^{● –}/H₂O₂ bronnen⁶bevatten. De meeste van deze sites zijn flavin bevatten enzymen die het genereren van een mengsel van O₂^●- en H₂O₂. Gebruik verschillende substraat of remmer combinaties zijn toegestaan voor de identificatie die respiratoire complexen en mitochondriale dehydrogenases dienen als^{hoge capaciteit O₂● –}/H₂O₂ vorming vestigingen in verschillende weefsels en³. PDHC en KGDHC is gebleken om te dienen als hoge capaciteit O₂^{● –}/H₂O₂ emitterende sites in spieren en lever mitochondriën^13,15. Bepaalde problemen blijven echter met betrekking tot het onderzoek van de O₂^{● –}/H₂O₂ vormen van afzonderlijke sites in mitochondriën en de invloed die verschillende substraat en remmer combinaties hebben op potentiële de activiteiten van de enzymen. Dit is te wijten aan de aanwezigheid van ongewenste kant Reacties (bijvoorbeeld, vorming van^{O₂● –}/H₂O₂ door sites dan het enzym van belang), besmetten endogene voedingsstoffen (bvvetzuren zuren) of organellen (b.v., peroxisomen die ook O₂^{● –}/H₂O_{2 vormen}), en gebruik van Remmers, dat het gebrek aan selectiviteit, en/of gebruik van stoffen die doen niet volledig ROS productie remmen. Bepaalde remmers kunnen ook veranderen de mitochondriale Bioenergetica en de richting van de stroom van elektronen, en dit verandert ROS release van andere sites van productie en kunstdiscours resultaten. Absolute tarieven voor O₂^{● –}/H₂O₂ release van afzonderlijke sites in mitochondriën zijn ook moeilijk te kwantificeren vanwege de hoge concentratie van O₂^●- en H₂O₂ de afschaffing van enzymen in de matrix en intermembrane ruimte. Eliminatie van eventuele concurrerende reacties die met O₂^{● –}/H₂O₂ release metingen interfereren kunnen kan dus nuttig bij het bepalen van de^{hoge capaciteit O₂● –}/H₂O₂ vormen van sites.

Hier presenteren we een eenvoudige methode die voor de gelijktijdige behandeling van O₂^{● –}/H₂O₂ productie en NADH vorming door gezuiverde flavin-afhankelijke dehydrogenases zorgt. Met behulp van gezuiverde enzymen, kunnen ongewenste ROS vormen kant reacties en ROS vernederende enzymen worden geëlimineerd zodat voor een meer nauwkeurige maatstaf van inheemse O₂^{● –}/H₂O₂ productie tarieven voor individuele flavoenzymes. Deze methode kan worden gebruikt om rechtstreeks vergelijken de O₂^{● –}/H₂O₂ vormen van de capaciteit van verschillende gezuiverde dehydrogenases of scherm potentiële site-specific remmers voor O₂^{● –}/H₂O ₂ release. Ten slotte kan meten O₂^{● –}/H₂O₂ en NADH productie gelijktijdig zorgen voor een real-time beoordeling van de relatie tussen de enzymactiviteit en ROS release capaciteit.