Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases
Summary
Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.
Abstract
Es wurde berichtet, dass Mitochondrien können bis zu 12 enzymatische Quellen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) enthalten. Ein Großteil dieser Seiten gehören Flavin-abhängige Atemwege komplexe und Dehydrogenases, die eine Mischung aus Superoxid (O2● –) und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu produzieren. Genaue Quantifizierung der ROS-Produktion Potenzial der einzelnen Standorte in isolierten Mitochondrien kann aufgrund des Vorhandenseins von antioxidativen Verteidigungssysteme und Nebenreaktionen, die auch O2●-/ h2O2bilden schwierig sein. Verwendung von unspezifische Inhibitoren, die mitochondriale Bioenergetik stören können kann auch Messungen beeinträchtigen, durch ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion ändern. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode für die gleichzeitige Messung von H2O2 -Version und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) Produktion von gereinigtem Flavin verbunden Dehydrogenases. Für unsere Zwecke hier haben wir gereinigten Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) und α-Ketoglutarate Dehydrogenase Komplex (KGDHC) Schweine Herz Ursprungs als Beispiele verwendet. Diese Methode ermöglicht eine genaue Messung der native H2O2 Freisetzungsraten von einzelnen Standorten der Produktion durch den Wegfall von anderen potenziellen Quellen von ROS und antioxidativen Systeme. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für einen direkten Vergleich des Verhältnisses zwischen H2O2 -Version und Enzym-Aktivität und die Prüfung der Wirksamkeit und Selektivität von Inhibitoren für ROS-Produktion. Alles in allem kann dieser Ansatz für die eingehende Beurteilung der native Raten von ROS Freigabe für einzelne Enzyme vor komplexere Experimente mit isolierten Mitochondrien oder permeabilized Muskelfaser ermöglichen.
Introduction
Das ultimative Ziel der Nährstoff Stoffwechsel ist Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. In Säugerzellen geschieht dies in den Mitochondrien, Doppel-membraned Organellen, die in Kohlenstoff in ATP gespeicherte Energie umwandeln. Die ATP-Produktion beginnt, wenn Kohlenstoff verbrannt von Mitochondrien bilden zwei Elektronen Träger, NADH und Flavin-Adenin-Dinucleotide (FADH2)1ist. NADH und FADH2 werden dann oxidiert durch Multi-Untereinheit Atemwege komplexe I und II, beziehungsweise, und die freigesetzten Elektronen werden auf das terminal Elektron Akzeptor molekularer Sauerstoff (O2) am Komplex IV1befördert. Die thermodynamisch günstigen “bergab” Übertragung von Elektronen auf O2 am Ende der Kette ist gekoppelt an den Export von Protonen in den Intermembrane Raum von komplexen I, III und IV. Dies schafft einen transmembranen elektrochemischen Gradienten von Protonen (Proton Motive Force), eine temporäre Form der freien Enthalpie von komplexen V zu ATP2getippt wird. Electron Transferreaktionen in den Mitochondrien sind nicht perfekt, ATP Produktion gekoppelt. An verschiedenen Punkten in der Krebs-Zyklus und die Atmungskette können Elektronen vorzeitig mit O2 Formular ROS3interagieren. O2●- und H2O2sind die biologisch relevanten ROS von Mitochondrien erzeugt. O2● – oft der proximalen ROS von Mitochondrien gebildet gilt, ist es jetzt offensichtlich, dass Produktionsstätten eine Mischung aus O2●- und H2O2 bilden, das ist verbunden mit dem kostenlosen radikale Chemie der Flavin prothetische Gruppen4,5. Auf einem hohen Niveau kann ROS gefährlich sein, biologische Bestandteile, die notwendig für die Zellfunktion durch oxidativen Stress6zu beschädigen. Allerdings in geringen Mengen erfüllen mitochondrialen ROS Signalisierung Vitalfunktionen. Zum Beispiel hat H2O2 -Version von Mitochondrien verwickelt, bei der Kontrolle der T-Zellaktivierung, Stress-Signalisierung (z.B. Induktion von Nrf2 Signalwege), die Induktion der Zell-Proliferation und Differenzierung, Insulin-Signal und Freigabe und Fütterung Verhalten7. Erhebliche Fortschritte im Verständnis der Signalisierung Funktion von ROS. Jedoch wichtige Fragen bleiben in Bezug auf die Enzyme in den Mitochondrien als die wichtigsten Quellen und dienen wie Produktion gesteuert wird.
ROS-Freigabe durch einen Aufstellungsort der Produktion hängt von mehreren Faktoren ab: (1) die Konzentration der Elektronen zu Spenden vor Ort, (2) die Redox-Status der Elektron Spenden Site, (3) Zugang zu Sauerstoff, und (4) die Konzentration und Art der Oxidation Substrat3, 8 , 9. in den Mitochondrien, andere Faktoren wie die Konzentration von NADH und Membran mögliche Stärke beeinflussen auch ROS Produktion8,10. Zum Beispiel erhöht die Rate der O2●-/ h2O2 Produktion von gereinigtem PDHC oder KGDHC mit zunehmender NADH Verfügbarkeit5,11. In diesem Szenario sind Elektronen von NADH zu FAD-Center in der E-3 -Untereinheit des PDHC oder KGDHC, der Website für O2● // h2O2 Produktion12rückwärts fließt. In ähnlicher Weise hat die Bereitstellung von NAD+ den gegenteiligen Effekt, abnehmender ROS Release von KGDHC12. So kann steuernde Eingang oder den Ausgang der Elektronen von ROS Produktionsstätten verändern wie viel O2●-/ h2O2 gebildet wird. Zum Beispiel blockiert der E-2 -Untereinheit PDHC oder KGDHC mit CPI-613, ein Liponsäure analog, Ergebnisse in fast 90 % O2●-/ h2O2 Produktion13verringern. Ähnliche Ergebnisse können mit chemischen S-Glutathionylation Katalysatoren, Diamide und Disulfiram, O2●-/ h2O2 Produktion von PDHC oder KGDHC über die Konjugation von Glutathion nach E fast abschaffen 2 -Untereinheit14. Der Nachteil für die Sperrung der Elektronenfluss durch die E-2 -Untereinheit des PDHC und KGDHC ist eine Abnahme der NADH-Produktion die ROS-Bildung durch den Elektronentransport-Kette (z.B.komplexe III) vermindert. Dies kann auch ATP Ausgabe durch den Elektronentransport-Kette verringern. Insgesamt kann blockieren Elektron Eintritt in ROS Produktionsstätten ein hochwirksames Mittel zur Produktionskontrolle O2●-/ h2O2 sein.
Mitochondrien können bis zu 12 mögliche O2●-/ h2O2 Quellen6enthalten. Die meisten dieser Seiten sind Flavin-haltige Enzyme, die eine Mischung aus O2●- und H2O2zu generieren. Verwendung von verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen konnten für die Identifizierung von denen Atemwege komplexe und mitochondriale Dehydrogenases dienen alshoher Kapazität O2●-/ h2O2 Standorte in Bildung verschiedenen Geweben3. PDHC und KGDHC haben gezeigt, als hoher Kapazität O2●-/ h2O2 emittierenden Websites in Muskeln und Leber Mitochondrien13,15dienen. Jedoch bleiben einige Schwierigkeiten in Bezug auf die Prüfung der O2●-/ h2O2 bilden einzelner Websites in Mitochondrien und die Auswirkungen, die verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen auf potenzielle die Aktivitäten der Enzyme. Dies ist aufgrund des Vorhandenseins von unerwünschten Nebenreaktionen (z.B. Bildung von O2●-/ h2O2 von Websites außer das Enzym von Interesse), verunreinigen endogenen Nährstoffe (z. B.Fettsäuren Säuren) oder Organellen (z. B., Peroxisomen bilden auch O2●-/ h2O2), und Gebrauch von Inhibitoren, die Selektivität fehlt und/oder Nutzung von Verbindungen, die nicht vollständig ROS Produktion hemmen. Bestimmte Inhibitoren können auch verändern die mitochondriale Bioenergetik und Richtung der Elektronenfluss, und dies ändert ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion und verwirrt Ergebnisse. Absolute Preise für O2●-/ h2O2 -Version von einzelnen Standorten in den Mitochondrien sind auch schwer zu quantifizieren, aufgrund der hohen Konzentration von O2●- und H2O2 Beseitigung von Enzymen in der Matrix und Intermembrane Raum. Beseitigung konkurrierende Reaktionen, die mit O2●-/ h2O2 Release Messungen stören können kann daher sinnvoll sein, beim Identifizieren von hoher Kapazität O2●-/ h2O 2 Seiten bilden.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, die für die gleichzeitige Prüfung der O2●-/ h2O2 Produktions- und NADH Bildung von gereinigten Flavin-abhängige Dehydrogenases ermöglicht. Durch die Verwendung gereinigter Enzyme, können unerwünschte Nebenreaktionen bilden ROS und ROS entwürdigende Enzyme ermöglicht ein genaueres Maß der nativen O2●-/ h2O2 Produktionsraten für individuelle Flavoenzymes eliminiert. Diese Methode kann verwendet werden, die O2●-/ h2O2 bilden Kapazität der verschiedenen gereinigte Dehydrogenases oder Bildschirm potenzielle ortsspezifische Inhibitoren für O2●-/ h2O direkt vergleichen 2 -Version. Schließlich können gleichzeitige Messung von O2●-/ h2O2 und NADH Produktion für eine Echtzeit-Bewertung des Verhältnisses zwischen Enzymaktivität und ROS Freisetzung Kapazität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist vorteilhaft da, (1) Es beseitigt alle konkurrierenden Reaktionen, die sonst mit H2O2 Nachweis (z.B., Antioxidans oder anderen Quellen von ROS), 2 stören können) bietet eine direkte Bewertung der einheimischen Rate ROS zu lösen, indem eine Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenase, 3) erlaubt den Vergleich der einheimischen ROS veröffentlichen Preise von zwei oder mehr gereinigt Flavin-basierte Dehydrogenases, 4) ermöglichen einen direkten Vergleich der Rate der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) finanziert. Video-Produktion erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Innovation in Lehre und lernen (CITL) an der Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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