מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי
Summary
המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.
Abstract
בעבר דווח כי המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 מקורות אנזימטי של מינים חמצן תגובתי (ROS). רוב האתרים הללו כוללים מתחמי הנשימה פלווין תלוית dehydrogenases המייצרים תערובת של סופראוקסיד (O2● –) מי חמצן (H2O2). כימות מדויק של הפוטנציאל לייצור ROS אתרים בודדים המיטוכונדריה מבודד יכול להיות מאתגר בשל נוכחותם של מערכות הגנה נוגדת החמצון ותגובות בצד כי גם טופס O2●/H2O2. השימוש מעכבי ספציפי יכול לשבש ביואנרגיה מיטוכונדריאלי גם להתפשר מדידות על ידי שינוי ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשקילת סימולטני H2O2 שחרור וייצור nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH) על ידי dehydrogenases מקושר פלווין מטוהרים. לענייננו כאן, השתמשנו מטוהרים פירובט דהידרוגנאז קומפלקס (PDHC) וα-ketoglutarate דהידרוגנאז מורכבים (KGDHC) ממוצא הלב חזירי כדוגמאות. שיטה זו מאפשר מדד מדויק של יליד H2O2 שחרור המחירים על ידי אתרים בודדים של הייצור על ידי ביטול מקורות פוטנציאליים אחרים של ROS ומערכות נוגד חמצון. בנוסף, שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה של היחסים בין H2O2 שחרור, פעילות אנזים, ההקרנה של יעילות, סלקטיביות של מעכבי לייצור ROS. באופן כללי, גישה זו תוכל לאפשר להערכה מעמיק של שיעורי מקורית של ROS שחרור עבור אנזימים בודדים לפני ביצוע ניסויים מתוחכמים יותר עם המיטוכונדריה מבודד או סיבי השריר permeabilized.
Introduction
המטרה הסופית של חילוף החומרים התזונתיים היא להפוך אדנוזין טריפוספט (ATP). בתרבית של תאים, הדבר מתרחש בתוך המיטוכונדריה, organelles כפול-membraned להמיר את האנרגיה המאוחסן הפחמן לתוך ATP. הייצור של ATP מתחילה כאשר פחמן התלקחות על ידי המיטוכונדריה ויוצרים שתי נושאות אלקטרון, NADH ו פלווין אדנין dinucleotide (FADH2)1. NADH ו FADH2 הם ואז תחמוצת על-ידי יחידת משנה רב מתחמי הנשימה I ו- II, בהתאמה, האלקטרונים המשוחרר הם שנהגים של אלקטרון מסוף מקבל חמצן מולקולרי (O2)-IV מורכבים1. למה חיובית “. בירידה” העברת אלקטרונים O2 בסוף השרשרת הוא מצמידים הייצוא של הפרוטונים לתוך intermembrane החלל על ידי קומפלקסים, השלישי, הרביעי. זה יוצר הדרגתי אלקטרוכימי transmembrane של פרוטונים (הכוח המניע-פרוטון), צורה זמני של אנרגיה חופשית של גיבס כי הוא טפח מאת V מורכבים להרוויח ATP2. תגובות העברת אלקטרונים המיטוכונדריה הם לא לגמרי ביחד לייצור ATP. בנקודות שונות של מעגל קרבס, שרשרת הנשימה, האלקטרונים יכולים בטרם עת לקיים אינטראקציה עם O2 לטופס ROS3. האבחון הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית שנוצר על ידי המיטוכונדריה הם2O● – ו H2O2. למרות2O● – נחשב לעתים קרובות את האבחון proximal הנוצרת על-ידי המיטוכונדריה, זה עכשיו ברור כי אתרי ייצור טופס תערובת של2O● – ו H2O2, אשר מזוהה עם חופשי כימיה הרדיקלית של תותבת פלווין מקבץ4,5. ברמה גבוהה, ROS יכול להיות מסוכן, גרימת נזק ביולוגי המרכיבים הדרושים לתפקוד התא וכתוצאה מכך מצוקה חמצוני6. אולם, ב כמויות נמוכות, ROS מיטוכונדריאלי למלא תפקידים חיוניים איתות. למשל, H2O2 שחרור המיטוכונדריה היה מעורב השליטה הפעלה T-cell, מתח איתות (למשל, אינדוקציה של Nrf2 איתות המסלולים), את תנאי הגיוס של התפשטות תא ובידול, אינסולין איתות שחרור ו האכלה התנהגות7. התקדמות ניכרת נעשתה בהבנת הפונקציה איתות של ROS. עם זאת, חשוב שאלות נותרו עדיין לגבי אשר אנזימים בתוך המיטוכונדריה לשמש המקורות החשובים ביותר ונשלט איך הייצור.
ROS שחרורו על ידי אתר הייצור תלוי במספר גורמים: 1) את הריכוז של אלקטרון תרומת באתר, 2) מצב חמצון-חיזור של אתר תורם אלקטרון, 3) גישה חמצן, ו 4) ריכוז וסוג של חמצון המצע3, 8 , 9. בתוך המיטוכונדריה, גורמים אחרים כמו הריכוז של NADH וכוח פוטנציאל ממברנה משפיע גם ROS הייצור8,10. לדוגמה, הקצב של O2●/H2O2 ייצור מטוהרים PDHC או KGDHC עולה עם הגדלת NADH זמינות5,11. בתרחיש זה, האלקטרונים זורמים לאחור מ- NADH אל מרכז אופנה יחידת משנה3 E של PDHC או KGDHC, דרך האתר O2● /H2O2 הפקה–12. באופן דומה, הפרשה של NAD+ יש השפעה הפוכה, הפחתת שחרור ROS KGDHC12. לפיכך, השליטה כניסה או יציאה של אלקטרונים מאתרי הייצור ROS יכול לשנות כמה O2●/H2O2 נוצר. למשל, חוסם את E2 יחידת משנה של PDHC או KGDHC עם מדד המחירים לצרכן-613, חומצה ליפואית אנלוגי, תוצאות כמעט 90% הדירי O2●/H2O-2 -הייצור-13. ניתן להשיג תוצאות דומות עם הכימי S-glutathionylation זרזים, diamide disulfiram, אשר כמעט לבטל את O2●/H2O2 ייצור PDHC או KGDHC דרך הבניין של גלוטתיון אל ה-E 2 יחידה משנית14. החלופה לחסימת זרימת אלקטרונים דרך יחידת משנה2 E של PDHC, KGDHC היא ירידה בייצור NADH אשר פוחתת היווצרות ROS ולחוליגנים תחבורה אלקטרון (למשל, השלישי מורכב). זה יכול גם להקטין פלט ATP על ידי שרשרת האלקטרונים תחבורה. בסך הכל, החוסם את האלקטרונים הכניסה לאתרים של ROS הייצור יכול להיות אמצעי יעיל שליטה O2●/H2O2 ייצור.
המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 פוטנציאליים O2● /H2O2 מקורות–6. רוב האתרים הללו נמצאים פלווין המכילים אנזימים אשר יוצרים תערובת של2O● – ו H2O2. השימוש סובסטרט שונים ושילובים מעכב אפשרו לצורך זיהוי אשר מכלולי מערכת הנשימה, dehydrogenases מיטוכונדריאלי לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 הקמת אתרים ברקמות שונות3. PDHC, KGDHC הוכחו לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 אתרים פולטות שריר, כבד המיטוכונדריה13,15. עם זאת, קשיים מסוימים יישארו לגבי הבדיקה של O2● –/H2O2 ויוצרים פוטנציאל של אתרים בודדים בתוך המיטוכונדריה ואת ההשפעה שיש סובסטרט שונים ושילובים מעכב על הפעילות של האנזימים. זאת בשל נוכחותם של תופעות לוואי בלתי רצויות (למשל, היווצרות O2●/H2O2 אתרים מלבד האנזים עניין), מזהם מזינים אנדוגני (למשל,שומן חומצות) או organelles (למשל, peroxisomes אשר גם טופס O2●/H2O2), השימוש מעכבי חסרי סלקטיביות, ו/או השימוש של תרכובות המעכבות לא לחלוטין ייצור ROS. מעכבי מסוימים עשויה גם לשנות את ביואנרגיה מיטוכונדריאלי והכיוון של זרימת אלקטרונים, זה משתנה ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור, מבלבל תוצאות. המחירים מוחלטת עבור O2●/H2O2 שחרור מאתרי בודדים בתוך המיטוכונדריה הם גם קשה לכמת בשל הריכוז הגבוה של2O● – ו H2O2 ביטול אנזימים בחלל מטריקס ו- intermembrane. לכן, חיסול של כל תגובות מתחרים יכולים להפריע O2● –/H2O2 שחרור מדידות יכולה להיות שימושית בעת זיהוי קיבולת גבוהה O2●/H2O2 יוצרי האתרים.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לבחינת סימולטני O2●/H2O2 ייצור ויצירת NADH מאת dehydrogenases תלויי-פלווין מטוהרים. באמצעות אנזימים מטוהרים, ROS להרכיב את ריאקציות צדדיות ולא ROS משפילים אנזימים רצוי ניתן לסלק המאפשר מדד מדויק יותר של יליד O2● –/H2O2 קצב ייצור עבור flavoenzymes בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות ישירות את O2●/H2O2 ויוצרים קיבולת שונה dehydrogenases מטוהרים או מעכבי בייעודי לאתר פוטנציאל מסך עבור O2●/H2O שחרור 2 . לבסוף, מדידת O2●/H2O2 וייצור NADH בו זמנית יכול לאפשר הערכה בזמן אמת של הקשר בין פעילות אנזים ROS שחרור קיבולת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה יש יתרון מאז, 1) היא מבטלת כל התגובות מתחרות שעשויים אחרת להפריע H2O2 זיהוי (למשל, מערכות נוגדי חמצון או מקורות אחרים של ROS), 2) מספק הערכה ישירה של קצב מקורי ROS לשחרר על-ידי המכילות פלווין מיטוכונדריאלי דהידרוגנאז, 3) מאפשר את ההשוואה של הילידים ROS לשחרר את המחירים של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). הפקת וידאו בוצע בשיתוף פעולה עם המרכז לחדשנות למידה (CITL)-אנדרטת והגבלות והוראה.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
