Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

Le but ultime du métabolisme des éléments nutritifs est de faire de l’adénosine triphosphate (ATP). Dans les cellules de mammifères, cela se produit dans les mitochondries, organites membrane double qui convertissent l’énergie stockée en carbone en ATP. La production d’ATP commence lorsque le carbone est brûlé par les mitochondries formant deux transporteurs d’électrons, NADH et la flavine adénine dinucléotide (FADH₂)¹. NADH et FADH₂ sont ensuite oxydé par sous-unité multiples complexes respiratoires I et II, respectivement, et les électrons libérés sont transportés à la terminal d’électron accepteur moléculaire l’oxygène (O₂) au complexe IV¹. Le thermodynamiquement favorable « descente » transfert d’électrons à O₂ à la fin de la chaîne est couplé à l’exportation des protons dans l’intermembranaire espace par les complexes I, III et IV. Cela crée un gradient électrochimique transmembranaire de protons (force proton-motrice), une forme temporaire d’énergie libre de Gibbs qui est exploité par complexe V faire ATP². Réactions de transfert d’électrons dans les mitochondries ne sont pas parfaitement couplées à la production de l’ATP. À divers moments durant le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, les électrons peuvent interagir prématurément avec O₂ pour former ROS³. Les ROS plus biologiquement pertinentes générées par les mitochondries sont O₂^{● –} et H₂O₂. O₂^{● –} est considéré souvent comme le ROS proximale formées par les mitochondries, il est maintenant évident que les sites de production de forment un mélange de O₂^{● –} et H₂O₂, qui est associé à la libre chimie radicalaire de flavin prothétique regroupe^4,5. Des niveaux élevés, ROS peuvent être dangereux, endommageant des constituants biologiques requis pour la fonction cellulaire résultant en détresse oxydante⁶. Toutefois, à de faibles quantités, ROS mitochondriales remplissent les fonctions vitales de signalisation. Par exemple, H₂O₂ libération des mitochondries a été impliquée en contrôlant l’activation des lymphocytes T, la contrainte de signalisation (par exemple, l’induction des voies de signalisation Nrf2), l’induction de la prolifération cellulaire et la différenciation, signalisation de l’insuline et libération et alimentation comportement⁷. Des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la fonction de signalisation de ROS. Cependant, importantes questions demeurent au sujet desquels enzymes dans les mitochondries servent de sources les plus importantes et la façon dont la production est contrôlée.

Communiqué de ROS par un site de production dépend de plusieurs facteurs : 1) la concentration de l’électrodonneur site, 2) l’état d’oxydoréduction du site Don électron, 3) l’accès à l’oxygène et 4) la concentration et le type d’oxydation substrat^{3, 8 , 9}. dans les mitochondries, d’autres facteurs comme la concentration de NADH et membrane force potentielle aussi influer sur la production de ROS^8,10. Par exemple, le taux de O₂^●-/ h₂O₂ production de purifiée CPD ou KGDHC augmente avec l’augmentation NADH disponibilité^5,11. Dans ce scénario, les électrons sont refluer de NADH vers le centre de la FAD dans la sous-unité de₃ E du CPD ou KGDHC, le site d’O₂^●-/ h₂O₂ production¹². De même, la fourniture de NAD⁺ a l’effet inverse, en diminuant la libération ROS du KGDHC¹². Ainsi, contrôle entrée ou sortie des électrons provenant de sites de production de ROS peut altérer combien O₂^●-/ h₂O₂ est formé. Par exemple, blocage de la sous-unité de₂ E de la CPD ou KGDHC avec un acide lipoïque analogique, diminuent des résultats dans un presque 90 % O₂^●-/ h₂O₂ production¹³, CPI-613. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec le chimique S-glutathionylation catalyseurs, diamide et disulfiram, qui abolir presque O₂●/h₂O₂ production de CPD ou KGDHC par l’intermédiaire de la conjugaison du glutathion au E ₂ sous-unités¹⁴. Le compromis pour bloquer le flux d’électrons par l’intermédiaire de la sous-unité de₂ E de la CPD et KGDHC y a une diminution dans la production de NADH qui diminue la formation de ROS par la chaîne de transport d’électrons (p. ex., complexe III). Cela peut également diminuer la production d’ATP par la chaîne de transport d’électrons. Dans l’ensemble, le fait de bloquer l’entrée des électrons à des sites de production de ROS peut être un moyen très efficace de contrôle de la O₂^●-/ h₂O₂ production.

Les mitochondries peuvent contenir jusqu’à 12 potentiels O₂^●-/ h₂O₂ sources⁶. La plupart de ces sites sont flavin-contenant des enzymes qui génèrent un mélange d’O₂^{● –} et H₂O₂. Utilisation de différents substrats et carboxypénicillines ont permis l’identification dont complexes respiratoires et déshydrogénases mitochondriales servent de haute capacité O₂^●-/ h₂O₂ formant des sites en ³de différents tissus. CPD et KGDHC ont démontré pour servir de grande capacité O₂^●-/ h₂O₂ sites émettant dans le muscle et les mitochondries du foie^13,15. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne l’examen de l’O₂^●-/ h₂O₂ formant des potentiels des sites individuels dans les mitochondries et l’impact ayant différents substrats et carboxypénicillines sur les activités des enzymes. Cela est dû à la présence de réactions secondaires indésirables (p. ex., formation de O₂^●-/ h₂O₂ par des sites autres que l’enzyme d’intérêt), contaminant nutriments endogènes (p. ex.,gras les acides) ou organites (p. ex., peroxysomes qui font également O₂^●-/ h₂O₂) et l’utilisation d’inhibiteurs que le manque de sélectivité, ou l’utilisation de composés qui n’inhibent pas complètement la production de ROS. Certains inhibiteurs peuvent également altérer la bioénergétique mitochondriale et la direction du flux d’électrons, et cela modifie ROS communiqué provenant d’autres sites de production et confond les résultats. Les taux absolus de O₂●/h₂O₂ libération de sites individuels dans les mitochondries sont également difficiles à quantifier en raison de la forte concentration d’O₂^{● –} et H₂O₂ éliminer les enzymes dans l’espace intermembranaire et de matrice. Par conséquent, élimination de toute réaction concurrente qui peuvent interférer avec l’O₂^●-/ h₂O₂ communiqué de mesures peut être utile lorsqu’on veut identifier haute capacité O₂^●-/ h₂O₂ formant des sites.

Nous présentons ici une méthode simple qui permet l’examen simultané de O₂^●-/ h₂O₂ production et de la formation de NADH par purifiée déshydrogénases flavin-dépendante. À l’aide d’enzymes purifiées, indésirables ROS formant des réactions secondaires et ROS enzymes dégradant peut être éliminé permettant une mesure plus précise des indigènes O₂^●-/ h₂O₂ taux de production pour chaque flavoenzymes. Cette méthode peut être utilisée pour comparer directement l’O₂^●-/ h₂O₂ formant la capacité des différents déshydrogénases purifiées ou aux inhibiteurs spécifiques au site potentiel écran pour O₂^●-/ h₂O version ₂ . Enfin, mesurant O₂^●-/ h₂O₂ et la production de NADH en même temps permet une évaluation en temps réel de la relation entre l’activité enzymatique et la capacité de sortie ROS.