Summary

人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

Published: March 23, 2018
doi:

Summary

人間のミルク、その他低バイオマス サンプル タイプから 16 s rrna ターゲット シーケンスの半自動化されたワークフローが表示されます。

Abstract

微生物の研究が比較的安価、迅速、かつ高スループット シーケンスの開発と普及します。しかし、これらのすべてのテクノロジと同様再現性のある結果は適切な予防とコントロールを組み込んだ室のワークフローに依存します。これは、バクテリアの DNA を汚染すると誤解を招く結果を生成できます低バイオマス サンプルと特に重要です。この記事は、低半ば throughput スケールの 16S リボソーム RNA (rRNA) V4 領域のターゲット シーケンスを使用して人間の母乳サンプルから微生物を識別するために半自動化されたワークフローを詳しく説明します。プロトコル記述から全乳を含む試料: 換散、核酸抽出、増幅 16S rRNA 遺伝子と品質への取り組みと図書館準備の V4 領域のサンプルします。重要なは、プロトコルおよび議論は顕著な準備と適切な正と負のコントロール、PCR 阻害物質の除去、サンプルの汚染を含む環境、試薬による低バイオマス試料の分析には、問題を考慮または実験のソース、および再現性を確保するために設計されたベスト ・ プラクティスの実験。前述のプロトコルは母乳サンプルに固有ですが、綿棒、きちんとした、または保全バッファーで安定化を凍結で収集されたサンプルを含む多数の低と高バイオマス サンプル タイプに適応されます。

Introduction

人間を植民地化する微生物は人間の健康、代謝、免疫の開発、疾患感受性と予防接種や薬物療法1,への応答に影響を及ぼす疾患はとても重要と考えられて2. 現在細菌叢の人間の健康に及ぼす影響を理解するための努力を強調内のローカライズされたサイトだけでなく、定義された解剖学的なコンパートメント(すなわち皮膚、腸、口腔など)に関連付けられている微生物の同定これらのコンパートメント3,では、4が。これらの調査の努力を支え、急速な出現と増加アクセシビリティ サンプルの微生物の遺伝の内容 (マイクロバイ) の解析の並列プラットフォームを提供する次世代シーケンサー (NGS) 技術です。多くの生理学的なサンプルに関連付けられたマイクロバイは複雑で豊富な (すなわちスツール), しかし、いくつかのサンプル、マイクロバイで表される (すなわち母乳、下気道) の低いバイオマス、感度、実験的工芸品および可能な汚染の主要な問題になります。マイクロバイ研究と適切な実験的なデザインの共通の課題複数レビュー記事5,6,7,8の対象とされています。

ここに記載した NGS の堅牢な実験的パイプラインは母乳のマイクロバイを特徴付ける rRNA の 16S V4 地域9のターゲット シーケンスに基づきます。人間のミルクのマイクロバイ分析は複雑なヒトの DNA レベル背景11,12,13,14の本質的に低いバイオマス10でだけ、また高と抽出した核酸の PCR 阻害剤15,16の潜在的な持ち越し。このプロトコルは、市販の抽出キットおよびサンプル調製バッチの間で変動を最小限に抑え、半自動化されたプラットフォームに依存します。プロトコルの各ステップを検証し、パイプラインの頑健性の独立したメトリックを提供する品質管理としてのサンプルと一緒に処理は、明確に定義された細菌モック コミュニティを組み込まれています。スツール、直腸、膣、皮膚、疎性結合、および経口綿棒10,17, を含む他のサンプル タイプに容易に適応可能であるそれとの開始点として使用できるプロトコルとしては説明母乳サンプルに固有ですが、マイクロバイ解析を実行したい研究者。

Protocol

すべてのプロトコルについては、適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要がありますと厳しい汚染防止アプローチが取られる必要があります。作業後の増幅作業領域のサンプルの汚染を最小限に抑えるために領域中古増幅から作業の流れを確認します。使用すべての供給、無菌、パイロジェン DNA、DNase、RNase の無料です。すべてのピペット チップ、フィルターされます。プロトコル手順の?…

Representative Results

ここで提示されたプロトコルには、生成されたデータのミートがプロトコルの感度、特異性、および汚染制御のベンチマーク テストを確認する重要な品質管理 (QC) 手順が含まれています。プロトコルの最初の品質管理手順に従います PCR 増幅 16S V4 地域 (図 2)。各サンプルからの PCR の製品の 1 つの μ L は 315 450 bp (図 2の赤?…

Discussion

16S rRNA の対象となる次世代シーケンスは、マイクロバイ評価18の広く使用されている、急速な手法です。バッチの効果、環境汚染、サンプルのクロスコンタミネーション、感度、再現性など、多くの要因が悪影響実験結果に影響を与えるし、その解釈7,19を混同,20. 良い実験的なデザイン、適切なコントロ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

プロトコルの開発の Helty Adisetiyo 博士と Shangxin 博士はヤンに感謝したいと思います。全体的なサポートのため、国際母性小児思春期エイズ臨床試験グループ (IMPAACT) は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の国立衛生の健康 (NIH) [受賞番号によって提供されました。UM1AI068632 (IMPAACT LOC)、UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) と UM1AI106716 (IMPAACT LC)、児童保健および人間の開発 (NICHD) のユーニス · ケネディ · シュライバーの国立研究所、国立精神衛生研究所 (NIMH) からの共同資金とします。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol  Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen  79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
 96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation  Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit  Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq    Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

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Cite This Article
Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

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