Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters
Summary
Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.
Abstract
Studies van microbiële gemeenschappen geworden wijdverbreide met de ontwikkeling van relatief goedkope, snelle en hoge doorvoer sequencing. Echter, zoals met al deze technologieën, reproduceerbare resultaten hangen af van een laboratorium-werkstroom waarin passende voorzorgsmaatregelen en over besturingselementen. Dit is vooral belangrijk met lage-biomassa monsters waar besmetting van bacteriële DNA kan misleidende resultaten genereren. In dit artikel een overzicht van een semi-geautomatiseerde workflow voor het identificeren van de microben van menselijke borst melkmonsters met behulp van gerichte sequentiebepaling van het 16S ribosomaal RNA (rRNA) V4 regio op een schaal voor de lage en Midden throughput. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters van volle melk inclusief: proeven van lysis, nucleic zuur extractie, versterking van de V4-regio van het 16S rRNA gen, en de voorbereiding van de bibliotheek met kwaliteitscontrole maatregelen. Nog belangrijker is, het protocol en de discussie punten in overweging nemen die meest opvallende aan de voorbereiding en analyse van lage-biomassa monsters zijn, met inbegrip van passende positieve en negatieve controles, de verwijdering van de Inhibitor van de omwenteling van de PCR, monster besmetting door milieu-, reagens, of experimentele bronnen, en experimentele praktijken ter verzekering van de reproduceerbaarheid. Terwijl het protocol zoals beschreven specifiek voor menselijke melkmonsters is, is het aan te passen aan de talrijke lage – en hoge-biomassa monster soorten, met inbegrip van monsters die op de wissers, bevroren puur of gestabiliseerde in een buffer van behoud.
Introduction
De microbiële gemeenschappen die mens koloniseren worden verondersteld te zijn kritisch belangrijk voor menselijke gezondheid en ziekte beïnvloeden metabolisme, immuunsysteem ontwikkeling, gevoeligheid voor ziekte en reacties op vaccinatie en drug therapie1, 2. inspanningen om te begrijpen van de invloed van de microbiota op de menselijke gezondheid op dit moment benadrukken de identificatie van microben gekoppeld omschreven anatomische compartimenten (d.w.z.huid, darmen, oral, etc.), evenals gelokaliseerde sites binnen Deze compartimenten3,4. Grondslag van deze investigative inspanningen is het snelle ontstaan en de grotere toegankelijkheid van volgende-generatie sequencing (NGS) technologieën die een massaal parallelle platform te voor analyse van de microbiële genetische inhoud (microbiome) van een steekproef bieden. Voor veel fysiologische monsters, de bijbehorende microbiome is zowel complexe en overvloedige (d.w.z., ontlasting), maar voor sommige monsters, het microbiome wordt vertegenwoordigd door lage microbiële biomassa (dat wil zeggenmenselijke melk, lagere luchtwegen) waar gevoeligheid, experimentele artefacten en mogelijke verontreiniging worden belangrijke kwesties. De gemeenschappelijke uitdagingen van microbiome studies en passende proefopzet hebben het voorwerp geweest van meerdere review artikelen5,6,7,8.
Hierin gepresenteerd is een robuuste NGS experimentele pijpleiding gebaseerd op gerichte sequentiebepaling van het rRNA 16S V4 regio9 te karakteriseren van de microbiome van menselijke melk. Microbiome analyse van menselijke melk is ingewikkeld, niet alleen door een inherent lage microbiële biomassa10, maar bovendien door hoge niveaus van menselijk DNA achtergrond11,12,13,14 en potentiële overdracht van PCR remmers15,16 in de uitgepakte nucleïnezuur. Dit protocol is afhankelijk van verkrijgbare extractie kits en semi-geautomatiseerde platformen die kunnen helpen bij het minimaliseren van de variabiliteit in de sample voorbereiding batches. Het bevat een welomschreven bacteriële mock Gemeenschap dat naast de monsters wordt verwerkt als een kwaliteitscontrole te valideren van elke stap in het protocol en het bieden van een onafhankelijke metric van de robuustheid van de pijpleiding. Hoewel het protocol als beschreven specifiek voor de menselijke melkmonsters is, het is gemakkelijk aan te passen aan andere steekproef vormen, met inbegrip van de ontlasting, rectaal, vaginale, huid, areolar en mondelinge swabs10,17, en kan dienen als uitgangspunt voor onderzoekers die willen microbiome analyses uitvoeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerichte volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is een veel gebruikte, snelle techniek voor microbiome karakterisering18. Echter kunnen vele factoren, met inbegrip van de effecten van de batch, milieuverontreiniging, monster kruisbesmetting, gevoeligheid en reproduceerbaarheid negatief beïnvloeden van experimentele resultaten en beschamen hun interpretatie7,19 , 20. om beste robuuste 16S a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Helty Adisetiyo, PhD en Shangxin Yang, PhD voor de ontwikkeling van het protocol. Algemene steun voor de internationale moeders Pediatric Adolescent AIDS klinische proeven groep (IMPAACT) werd verzorgd door de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) onder de nummers van de Award UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) en UM1AI106716 (IMPAACT LC), met medefinanciering uit de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD) en het National Institute of Mental Health (NIMH). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
