أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري
Summary
ويرد سير شبه الآلي لتسلسل الرنا الريباسي 16S من اللبن البشري وأنواع العينة منخفض-الكتلة الأحيائية الأخرى المستهدفة.
Abstract
وقد أصبحت دراسات المجتمعات الميكروبية على نطاق واسع مع وضع تسلسل غير مكلفة نسبيا والسريع، وارتفاع الإنتاجية. ومع ذلك، كما هو الحال مع جميع هذه التكنولوجيات، تعتمد النتائج استنساخه على سير عمل مختبر الذي يشتمل على الاحتياطات اللازمة والضوابط. وهذا أهمية خاصة مع العينات منخفضة-الكتلة الحيوية حيث تلويث الحمض النووي البكتيري يمكن أن تولد نتائج مضللة. هذه المادة تفاصيل سير شبه الآلي التعرف على الميكروبات من عينات حليب الثدي البشري استخدام تسلسل المستهدفة من منطقة V4 الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) 16S على نطاق throughput منخفضة إلى متوسطة. وصف البروتوكول إعداد عينة من الحليب الكامل الدسم بما في ذلك: عينة تحلل، واستخراج الحمض النووي، والتضخيم من منطقة V4 16S الرنا الريباسي الجينات، وإعداد مكتبة بتدابير مراقبة الجودة. الأهم من ذلك، البروتوكول والمناقشة النظر في القضايا التي البارزة في إعداد وتحليل العينات منخفضة-الكتلة الحيوية بما في ذلك الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية، وإزالة المانع بكر، تلوث العينة بالبيئية، الكاشف، أو مصادر تجريبية، وأفضل الممارسات التجريبية الرامية إلى ضمان إمكانية تكرار نتائج. حين البروتوكول كما هو موضح محددة لعينات اللبن البشري، أنها قابلة للتكيف للعديد من أنواع عينة الكتلة الأحيائية المنخفضة والعالية، بما في ذلك عينات جمعت في مسحات، مجمدة نظيفة، أو استقر في المخزن مؤقت الحفاظ على.
Introduction
يعتقد أن المجتمعات الميكروبية التي استعمار البشر أن تكون الأهمية لصحة الإنسان، والأمراض التي تؤثر على الأيض والتنمية محصنة والتعرض للمرض، والردود على التطعيم والمخدرات العلاج1، 2-التأكيد على الجهود المبذولة لفهم تأثير الحجمية على صحة الإنسان حاليا تحديد الميكروبات المرتبطة بالمكونات التشريحية المحددة (أي، الجلد، الأمعاء، عن طريق الفم، إلخ)، فضلا عن مواقع محلية داخل هذه المقصورات3،4. التي تدعم هذه الجهود التحقيق هو الظهور السريع، وزيادة إمكانية الحصول على تكنولوجيات الجيل التالي التسلسل (خ ع) التي توفر منصة موازية على نطاق واسع لتحليل محتوى الجينية الميكروبية (ميكروبيومي) من عينة. للعديد من عينات الفسيولوجية، ميكروبيومي المرتبطة بها على حد سواء معقدة ووفرة (أيالبراز)، ولكن لبعض العينات، ممثلة في ميكروبيومي بانخفاض الكتلة الحيوية الميكروبية (أي، واللبن البشري، والجهاز التنفسي السفلي) حيث حساسية والتحف الفنية التجريبية، والتلوث المحتمل تصبح القضايا الرئيسية. التحديات المشتركة في الدراسات ميكروبيومي والتصميم التجريبي المناسب قد خضعت متعددة استعراض المواد5،6،،من78.
المقدمة في هذه الوثيقة هو خط أنابيب تجريبية قوية خ ع استناداً إلى المستهدفة تسلسل الرنا الريباسي 16S V4 المنطقة9 تميز ميكروبيومي اللبن البشري. التحليل ميكروبيومي اللبن البشري معقدة ليس فقط طبيعتها منخفضة الكتلة الحيوية الميكروبية10، بل بالإضافة إلى ذلك بارتفاع مستويات الحمض النووي البشري الخلفية11،12،،من1314 و احتمال ترحيل PCR مثبطات15،16 في الحمض النووي المستخرج. يعتمد هذا البروتوكول على مجموعات استخراج المتاحة تجارياً ومنصات شبه الآلية التي يمكن أن تساعد في تقليل التغير عبر نموذج إعداد دفعات. ويضم مجتمع صورية بكتيرية المعالم التي يتم معالجتها جنبا إلى جنب مع عينات كعنصر تحكم الجودة للتحقق من صحة كل خطوة في البروتوكول، وتوفير مقياس مستقل من متانة الأنابيب. ورغم أن البروتوكول كوصف محدد لعينات اللبن البشري، وهو القابلة للتكييف وفقا لأنواع العينة الأخرى بما في ذلك البراز، المستقيم، المهبل، والجلد، ومسحات أريولار، وعن طريق الفم10،17، ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق الباحثين الذين يرغبون في إجراء تحليلات ميكروبيومي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستهدف الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S تقنية تستخدم على نطاق واسع وسريع ل توصيف ميكروبيومي18. ومع ذلك، العديد من العوامل، بما في ذلك الآثار دفعة والتلوث البيئي، والتلوث عبر العينة، حساسية وإمكانية تكرار نتائج يمكن أن تضر بالنتائج التجريبية وارباك على تفسير7<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر هيلتي أديسيتييو، دكتوراه، وشانجكسين يانغ، دكتوراه لتطوير البروتوكول. وقدمت الدعم الشامل للدولي الأمهات طب الأطفال المراهقين الإيدز السريرية المحاكمات المجموعة (إيمباكت) “المعهد الوطني للحساسية” والأمراض المعدية (نييد) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ضمن “أرقام جائزة” UM1AI068632 (خط إيمباكت)، UM1AI068616 (إيمباكت سدمك) و UM1AI106716 (LC إيمباكت)، بتمويل مشترك من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
