Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока
Summary
Полуавтоматические рабочего процесса представлен целевой последовательности 16S рРНК от материнского молока и других видов биомассы температура образца.
Abstract
Исследования микробных сообществ стали широко с развитием виртуализации сравнительно недорогой, быстрый и высокой пропускной способности. Однако как с всеми этими технологиями, воспроизводимые результаты зависят от лаборатории рабочий процесс, который включает в себя надлежащие меры предосторожности и контроля. Это особенно важно с низким биомассы образцов, где заражения бактериальной ДНК может генерировать заблуждение результаты. Эта статья подробно описывает полу автоматизированный рабочий процесс для идентификации микробов из образцов молока груди человека с помощью целенаправленных последовательности региона V4 16S рибосомная РНК (рРНК) низкого и среднего throughput масштабе. Протокол описывает пробоподготовки от цельного молока в том числе: образца лизиса, извлечения нуклеиновой кислоты, усиление V4 региона гена 16S рРНК, и библиотека с мерами контроля качества. Важно отметить, что протокол и обсуждения рассмотреть вопросы, которые характерных для подготовки и анализа образцов низкой биомассы, включая соответствующие позитивные и негативные элементы, ПЦР ингибитор удаления, пример загрязнения окружающей среды, реагент, или экспериментальных источников и экспериментальной наилучшей практики, призванные обеспечить воспроизводимость. В то время как протокол, как описано для образцов человеческого молока, он адаптируется к многочисленные типы биомассы низкого и высокого образца, включая пробы на палочки, замороженные аккуратные, или стабилизации в буфере сохранения.
Introduction
Считается, что микробных сообществ, которые колонизировали людей являются критически важным для здоровья человека и болезнь влияющих на метаболизм, иммунных развития, восприимчивость к болезням и ответы на вакцинацию и наркотики терапия1, 2. подчеркнуть усилия, чтобы понять влияние микробиоты на здоровье человека в настоящее время идентификации микробов, связанные с определенными анатомическими отсеков (т.е., кожи, кишечника, Оральный секс, и т.д.), а также локализованные сайты в рамках Эти отсеки3,4. Лежащие в основе этих следственных усилий является быстрое появление и увеличение доступности технологий следующего поколения последовательности (НГС), которые предоставляют массивно параллельной платформу для анализа содержания микробных генетических (микрофлора) образца. Для многих физиологических образцы, связанные микрофлора комплекс и обильные (то есть, стул), но для некоторых образцов, микрофлора представлена низкими микробной биомассы (то есть, человеческое молоко, нижних дыхательных путей) где чувствительность, экспериментальных артефактов и возможного загрязнения становятся основным вопросам. Общие проблемы исследований микрофлора и соответствующий экспериментальный дизайн были предметом нескольких обзор статей5,6,,78.
Представленные здесь надежные экспериментальные трубопровода NGS основан на целевые последовательности рРНК 16S V4 региона9 характеризовать микрофлора грудного молока. Анализ микрофлора грудного молока сложен не только низких микробной биомассы10, но дополнительно высокий уровень ДНК человека фон11,12,13,14 и потенциальные уноса ПЦР ингибиторы15,16 в извлеченной нуклеиновых кислот. Этот протокол основывается на коммерчески доступных извлечения наборы и полуавтоматические платформ, которые могут помочь свести к минимуму колебаний через образец подготовки пакетов. Она включает в себя четко определенных бактериальных макет сообщество, которое обрабатывается вместе с образцами, как контроль качества проверяет каждый шаг в протоколе и обеспечить независимый метрики надежности трубопроводов. Хотя протокол как описано специфичен для образцов материнского молока, он легко адаптируется для других образцов типов включая стула, ректальные, вагинальные, кожи, рыхлой и устные тампоны10,17и может служить отправной точкой для Исследователи, которые желают выполнять анализ микрофлора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целевые секвенирование нового поколения 16S рРНК методика широко используется, быстрое микрофлора характеристика18. Однако многие факторы, включая пакет эффектов, загрязнение окружающей среды, пример перекрестного загрязнения, чувствительность и воспроизводимости может ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Helty Adisetiyo, PhD и Ян Shangxin, PhD для развития протокола. Общая поддержка для международного материнской педиатрических подростков СПИДа клинических испытаний группы (IMPAACT) была представлена в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) из национальных институтов здравоохранения (НИЗ) под номерами премии UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) и UM1AI106716 (IMPAACT LC), при совместном финансировании от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека (NICHD) и Национальный институт психического здоровья (NIMH). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
