تصور المتداول الكريات البيض والالتصاق في الفئران التي غرست الثاني انجيوتنسين: تقنيات والمزالق
Summary
هذه المخطوطة يصف استخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل وطرق الإدارة المختلفة من الأصباغ الفلورية في انجيوتنسين الثاني-فرط ضغط الدم المحرض باستخدام مجهر الفيديو إينترافيتال من الأوعية الدموية لتقييم تفعيل الخلايا المناعية وبهم القدرة على دحر والتمسك بالبطانة.
Abstract
ابيفلوريسسينسي المجهري الفيديو إينترافيتال (ناقلات) الأوعية الدموية أسلوب المتبعة لتقييم تفعيل الخلايا المناعية وقدرتهم على الدور والالتزام بالطبقة غشائي. ويشيع استخدام التصور لتعميم خلايا بحقن الأصباغ الفلورية أو الأجسام المضادة إلى جانب فلوروفوري. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الفئران مراسل الفلورسنت. التفاعلات بين الكريات البيضاء، بخاصة ليسوزيمي م+ (+) وحيدات، مع جدار الوعاء دوراً محوريا في تعزيز الخلل في الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم الشرياني. نقدم هنا هذه التقنية لتصور وتحديد كمية الكريات البيض المتداول والالتصاق في الشرايين السباتي في انجيوتنسين الثاني (أنجي)-التي يسببها ارتفاع ضغط الدم في الفئران من ناقلات الأمراض.
زرع قسطرة يضر جدار الأوعية الدموية، ويؤدي إلى استجابات تغيير خلايا الدم. نحن مقارنة تقنيات الحقن المختلفة وطرق الإدارة لتصور الكريات البيضاء في ليسمكري++ أسندت الماوس مع التعبير على نطاق واسع من البروتين الأحمر نيون والتعبير الشرطي من البروتينات الفلورية الخضراء في ليسم + الخلايا. لدراسة+ خلية التنشيط، استخدمنا AngII غرست الفئران فيها المتداول والتصاق الكريات البيضاء إلى البطانة هو زيادة. نحن أما حقن أكريديني البرتقالي باستخدام حبل القسطرة أو مباشرة على الرغم من الذيل الوريد ومقارنة الكمية المتداول والتقيد بالخلايا. وجدنا أن زرع القسطرة جوجولار في حد ذاتها إلى زيادة عدد المتداول والمنضمة إليها الخلايا+ في الشام غرست ليسمكري+الفئران سيبحث+ بالمقارنة مع عناصر التحكم. تمت زيادة هذا التنشيط في الفئران التي غرست أنجيي. من المثير للاهتمام، التصاق الخلايا أكريديني البرتقالي مباشرة عن طريق الذيل المنطلق لا تزيد+ بالحقن أو المتداول في الفئران التي غرست الشام. وبالتالي نحن أثبتت أهمية الفئران المعدلة وراثيا مراسل معربا عن البروتينات الفلورية لا تتداخل مع عمليات في فيفو أثناء التجريب. وعلاوة على ذلك، قد يكون حقن الوريد الذيل من تتبع الفلورسنت بديلاً ممكناً لحقن القسطرة jugular.
Introduction
ارتفاع ضغط الدم الشرياني يزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والموت، ويعزز التنمية لتصلّب الشرايين، وأمراض القلب والشرايين، وثرومبومبوليسمس الشرياني أو الوريدي1. تطوير ارتفاع ضغط الدم يعتمد على التفاعل بين العوامل البيئية والوراثية والغدد الصماء والفسيولوجية. حاليا، تقدر الحصانة والتهاب ذات الصلة أن تلعب دوراً هاما في مسببات ارتفاع ضغط الدم2.
بين الخلايا المناعية، وجد أن أن تشارك سببياً في التهاب الأوعية الدموية الناجمة عن أنجي وارتفاع ضغط الدم، في الجزء المتصلة بقدرتهم على تحريك أنواع الأكسجين التفاعلية3لمفاوية T، فضلا عن وحيدات والضامة. بلعم محفزة لمستعمرة عامل ناقص الفئران أظهرت انخفاض ردا على أنجي فيما يتعلق بزيادة ضغط الدم والتهاب الأوعية الدموية4. في أعمال سابقة، يمكن أن نظهر أن محرك ليسم + وحيدات الخلل في الأوعية الدموية والتهاب في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن أنجي5. في الآونة الأخيرة، وصفت لنا طريقا رواية التي تخثر العامل الحادي عشر تتعاون مع الصفائح الدموية وجدار الوعاء للحث على التهاب الأوعية الدموية ثرومبين-تعتمد على6. كان مؤخرا تلخيص المعارف الحالية حول دور الجهاز المناعي في ارتفاع ضغط الدم واستعرضها رودريغيز-ايتوربيه وآخرون. 7
وبالمشاركة الخلايا المناعية في تطوير ارتفاع ضغط الدم أصبح واضحا، أصبح من الضروري نماذج وتقنيات لدراسة التفاعل بين السفينة والخلايا المناعية. ابيفلوريسسينسي ناقلات الأمراض الأوعية الدموية أداة مفيدة لمراقبة في فيفو التفاعلات بين تعميم خلايا الدم و البطانة8،،من910. مع هذه التقنية، يمكن تصور حقن الأصباغ إينتيركالاتينج مع الحمض النووي (مثل البرتقال أكريديني) الخلايا المنواه (المتداولة، وكذلك من البطانة). الصفائح الدموية المعزولة الملون السابقين فيفو مع رهودامين-6 ز أو يمكن حقن ديتشلوروفلوريسسين (DCF) لتصور خثرة الغنية بالصفائح الدموية في نماذج الإصابة الشريانية أو الوريدية.
عادة، تستخدم لحقن مواد استشفاف قسطرة الوريد أو وضع علامة على الصفائح الدموية. تغيير البطانة والتنشيط اللاحقة من تتالي تخثر الدم سواء معروفة آثاراً على تفعيل الوحيدات. إصابة غشائي فورا يؤدي إلى تنشيط الصفائح الدموية عن طريق الجزيئات مصفوفة سوبيندوثيليال لختم الأنسجة، التي تلت ذلك الجذب والتنشيط الوحيدات11. على العكس من ذلك، المعروف بطانة سليمة خصائص التخثر (مثلاً، عن طريق الأنسجة عامل مثبط مسار أو ثرومبومودولين)12 والآثار المثبطة المباشرة على الوحيدات، مثلاً، عن طريق إفراز حويصلات خارج الخلية التي تحتوي على ميكرورناس13. وحيدات معروفة لإنتاج عامل نسيج، المنشط الخارجية تتالي التخثر والتعبير عن مستقبلات حوزتي المنشط (بارس) أن المشاركة في الوحيدات التنشيط14،15 ويمكن تنشيطه بواسطة ثرومبين . ولذلك، أي تنشيط الصفائح الدموية أو تتالي تخثر الدم نتيجة إصابة الأوعية الدموية قد آثار غير متوقعة على تفعيل الوحيدات وتتداخل مع هذه الظاهرة الملحوظة. مع المساعدة من أسندت المعدلة وراثيا Cre ليسم الفئران المعدلة وراثيا، ماوس مراسل Cre الفلورسنت مزدوجة (ليسمكري+أسندت+)، نقترح دراسة تأثير الحقن بالتفصيل مع أساليب القسطرة والبديل في+ حيدي الخلايا الموجودة في نموذج الفأر من ارتفاع ضغط الدم الشرياني16.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعرضت وحيدات+ سابقا أنه متورط في تطوير ارتفاع ضغط الدم5. هنا نظهر أن الخلايا المناعية+ رول والتمسك بالطبقة غشائي ردا على ضخ أنجي. تم الحصول على هذه النتيجة باستخدام ليسمكري++ أسندت الفئران من دراساتنا السابقة استكشاف دور الخلايا المناعية في ارتفاع ضغط الدم في فيفو بتصور الكريات البيضاء مع حقن أكريديني البرتقالي6،10. وهكذا، لم يكن من الممكن تمييز أنواع الخلايا التمسك بالبطانة.
ناقلات الأمراض أداة مفيدة جداً للدراسات والأوعية الدموية و في فيفو ملاحظات الخلايا مباشرة في المفرج، ولكن ما زال أثر حقن الأصباغ مع المساعدة من قسطرة جراحيا المدرجة في سياق التحريضية لارتفاع ضغط الدم غير معروف. لتقييم الأثر المحتمل للقسطرة وأكريديني البرتقالي حقن أخذنا استفادة ليسمكري+الفئران سيبحث+ . ضخ أنجيي زاد العدد المتداول الخلايا+ للبطانة. إدخال قسطرة في الوريد تضخيم التأثير والكريات البيضاء أكثر المتداول والمنضمة إليها، تم الكشف عن الفئران التي غرست AngII تجهيزها قسطرة مقارنة بالفئران دون زرع القسطرة. يشير هذا إلى أن غرس أسباب القسطرة السباتي فعل التهابات الجهازية في السياق التئام ذلك التراكبات مع رد فعل المناعة في18من ارتفاع ضغط الدم. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً للقرب من حبل الوريد إلى الشريان السباتي تنشيط المناعي إضافية ربما يكون قد حدث يؤثر على حبل الوريد. أن هذا التأثير لم يكن حاضرا عندما قدمت حقن الوريد الذيل مباشرة، يمكننا أن نفترض أن التأثير كان من المقرر إلا الصبغة أن الإجراء من إدخال القسطرة. ونحن هنا أثبتت أهمية الفئران المعدلة وراثيا مراسل معربا عن البروتينات الفلورية لا تتداخل مع عمليات في فيفو أثناء التجريب. وعلاوة على ذلك، قد يكون حقن الوريد الذيل من تتبع الفلورسنت بديلاً ممكناً لحقن القسطرة jugular.
خطوة حاسمة واحدة من هذا الإجراء هو ضخ أنجي. يمكن إجراء تقييم الكفة الذيل من ضغط الدم بغية التحكم في فعالية تقديم AngII بالمضخة. وينبغي زيادة ضغط الدم بعد أيام 2−3 للتسريب. للحد من الالتهابات التي يمكن أن تؤثر في تنشيط الخلايا+ ، ينبغي إغلاق شق حيث يتم زرع المضخة بخياطة الجروح بدلاً من القصاصات. يجب الإشارة إلى حد واحد عن حقن الوريد الذيل: جعل اقتناء البيانات الممكنة أفضل 4 أشرطة الفيديو تتخذ عادة لكل السباتي. إذا انخفضت إشارة الفلورسنت، يتم حقن 50 ميليلتر من أورانج أكريديني لكن مع حقن ذيل أنها أكثر صعوبة لجعل الحقن عدة وللحفاظ كاروتيدس مستقرة تحت المجهر والهدف. قد تعدل مدة وجود قسطرة في حبل الوريد أيضا تنشيط الخلايا المناعية نظراً لأنها تؤثر على تفعيل تخثر الدم في البلازما الغنية بالصفائح الدموية المعدة ح 4 بعد زرع القسطرة19. هذا الجانب من زرع قسطرة يحتاج إلى مزيد من التحقيق.
أخيرا، حتى لو أننا نقدر أثر زرع القسطرة جوجولار على+ خلية التنشيط بعد ضخ أنجي، نحن لا تماما تقدير دور إعداد وإزالة الجلد، وعزل السباتي في خلية+ المحتملة التنشيط. نخلص إلى أن استخدام الفئران مراسل الأسفار مثل ليسمكري++ أسندت يوصي بالماوس لتفادي الإخلال بسلامة السفينة أثناء إعداد الحيوانات للتصوير في فيفو .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث (01EO1003 الألمانية والألمانية 01EO1503).
Materials
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
References
- Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
- Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
- Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
- De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
- Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
- Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
- Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
- Hinsbergh, V. W. Endothelium–role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
- Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
- Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
- Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes–role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
- Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. , (2017).
