Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges

Des expériences ont été menées sur l’âge des souris mâles âgés sous l’approbation du Comité d’éthique sur l’expérimentation animale du Land de Rhénanie-Palatinat (numéro d’autorisation de 23 177-07/G12-1-002 et 23 177-07/G15-1-051) de 8 à 12 semaines. 1. préparation de la chirurgie et l’anesthésie de souris Avant l’opération, vérifier la bonne santé et la condition des animaux. Avant la chirurgie, surveiller les animaux une fois par jour pendant 2-3 jours de leur état général (apparence, attitude, comportement spontané) ainsi que la consommation d’eau, de nourriture et poids corporel. Préparer le mélange maître anesthésie avec le midazolam (5 mg/kg de poids corporel), médétomidine (0,5 mg/kg de poids corporel) et le fentanyl (0,05 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale (i.p.) injecter 200 µL/30 g souris dans la seringue de 1 mL avec une aiguille de 26 G. Implantation de pompe osmotique et préparation animaux pour des expériences IVM sont exécutées sur un champ d’opération avec un 39 ° C de réchauffement plate-forme. Stériliser tous les outils dans un bain de désinfection et désinfecter la plate-forme de réchauffement de la planète. Au cours de la procédure, protéger les yeux animaux avec pommade ophtalmique. Enlever la fourrure avec des rasoirs avant l’implantation de pompe osmotique. Utilisez une crème dépilatoire et cotons-tiges pour isoler des carotides et implantation de cathéter jugulaire dans les expériences de l’IVM. Désinfecter la peau d’un animal à l’aide de deux désinfectants de la peau : un antiseptique et désinfectant contenant la polyvidone iodée et une peau antiseptique octenidine contenant en solution à base d’alcool. Préparer le mélange maître d’antagoniser l’anesthésie (« antisedan mix ») avec atipamezol (0,05 mg/kg de poids corporel) et flumazénil (0,01 mg/kgdepoids poids) et de préparer 200 µL/souris dans la seringue de 1 mL avec aiguille 26 G jusqu’à être par voie sous-cutanée (s.c.) injecté. 2. implantation et préparation de la pompe osmotique Remarque : L’infusion AngII sous-cutanée à l’aide de pompes osmotiques a été décrite en détail par Lu et al. 17 Préparer l’AngII en reconstituant la poudre lyophilisée avec du sérum physiologique stérile et ajuster la concentration avec le poids de l’animal et le débit de la pompe. Garder l’AngII reconstituée dans des tubes en plastique (ne pas utiliser de tubes de verre). Remplir les pompes avec la solution AngII pour livrer 1 mg/(kg·d) pendant 7 jours. Après la préparation, maintenir les pompes dans une solution saline stérile pendant 4-6 h minimum à 37 ° C. Tester l’anesthésie complète de la souris après injection de la combinaison de l’anesthésie avec arrière réflexes des pieds et placez-le sur le champ de fonctionnement chaud. Induction de l’anesthésie prend 10-15 min et fonctionne mieux si les animaux sont placés dans un environnement sombre. Se raser le bas du dos de la souris et les désinfecter avec une antiseptique de la peau alcoolique. Faire une incision de 1 cm perpendiculairement à la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux. Créer une poche pour la pompe à l’aide d’une pince hémostatique du détroit et introduire la pompe (débit tout d’abord le modérateur). La poche doit permettre la libre circulation de la pompe sans aucune pression sur la plaie. Refermer la plaie avec des points de suture et pas de pinces, afin de limiter l’inflammation ; puis désinfecter avec antiseptique de la peau. Antagoniser l’anesthésie par injection s.c. 200 µL du mélange antisedan et regagner sa cage de la souris. Réaliser l’analgésie postopératoire avec la buprénorphine (0,075 mg/kg s.c.) une seule fois après la chirurgie et à la demande selon le comportement animal. 3. Implantation de cathéter jugulaires et carotides préparation Tester l’anesthésie complète de la souris après injection de l’anesthésie se mêlent les réflexes alimentaires arrière et placez l’animal anesthésié dans recumbence dorsal sur la plaque chirurgicale de 39 ° C avec une sonde rectale afin de maintenir la température et mettre la pommade sur les yeux pour les protéger pendant la procédure. Enlever les poils du cou à l’aide de la crème dépilatoire. Utilisez un coton-tige pour répandre et frotter la crème pendant 2 min jusqu’à ce que les poils commencent à tomber. Après un 2 min supplémentaire, retirer la crème et les poils avec une spatule et désinfecter la peau avec une antiseptique de la peau alcoolique. Effectuer la chirurgie sous un stéréomicroscope. Faire une incision longue de 1 à 1,5 cm dans la peau longitudinalement dans le cou, 1 cm à côté de la trachée. Ensuite, faire deux autres incisions perpendiculairement aux deux extrémités des incisions premières. Retirer les tissus à côté de la peau soigneusement et enlever le morceau de peau recouvrant la veine jugulaire gauche et la trachée. Isoler soigneusement la glande parotide ; glandes sublinguales et sous-maxillaires de la zone d’intérêt avec une pince courbe 2. Ne pas couper ou endommager les glandes, placez-les pour permettre le meilleur accès à la veine jugulaire et aux carotides. Pour isoler la veine jugulaire, utiliser des pinces fines et ouvrir lentement et fermez-le pour libérer doucement le navire du tissu environnant. Une fois la veine est parfaitement propre, positionner la pince sous le vaisseau et placer deux sutures 7-0 de 10 cm de chaque sous lui. Fermer la suture proximale à la tête par deux nœuds. Sur les autres sutures, préparer 1 noeud, mais ne le fermez pas. Maintenir le cathéter (0,28 mm diamètre intérieur, diamètre extérieur 0,61 mm) rempli d’une solution saline stérile à 37 ° C avec une pince d’une main ; alors qu’avec l’autre main, faire une petite incision dans le vaisseau avec une paire de ciseaux fine ou une aiguille courbe de 26 G. Ensuite insérer le cathéter dans la veine jugulaire et fermer le noeud deux fois. Fermer la suture proximale à la tête sur le cathéter afin d’assurer l’immobilisation complète. Pour isoler et préparer les artères carotides, disséquer la superficie de la trachée avec une pincette courbée fine. Une fois les carotides sont libres des tissus environnants, enlever le nerf de vagus (qui ressemble à une ligne blanche adjacente à la carotide) du navire (mais ne pas couper). La pince fine peut être fermée et ouvert lentement afin de mobiliser doucement le nerf. Une fois que les deux artères sont complètement propres, placer la pince sous la première artère carotide et placer un petit noir 3 mm large x 2,5 cm longueur morceau de plastique sous le bateau. Il est très important de ne pas grever le navire et pour vérifier que le flux sanguin est présent une fois que le titulaire du navire est placé. Placez le deuxième artère au-dessus du support à bateau. Si la souris ne se trouve pas directement sous le microscope, remettre en place les glandes sur la trachée et appliquer une solution saline stérile à 37 ° C pour éviter le dessèchement de la zone. 4. Evaluation de laminage et d’adhérence des leucocytes / LysM + cellules avec IVM Préparer l’acridine orange d’une solution mère de 2 mg/mL, conservée à-20 ° C et le diluer 1 / 4 dans du sérum physiologique stérile (concentration finale de 0,5 mg/mL) dans une seringue de 1 mL.Protéger la seringue de la lumière et utiliser 200 µL par une souris. Tester des conditions différentes : (1) Injection de l’acridine orange avec le cathéter jugulaire ; (2) injection de l’acridine orange directement dans la veine latérale de queue (avec cette condition que sans cathéter Jugulaire a été implanté) ; (3) mesure sans souris l’acridine orange en utilisant la fluorescence LysMCre++ d’IRG (là encore sans cathéter Jugulaire a été implanté). Une fois le cathéter est en place et les deux carotides sont isolées, positionnez la souris sous le microscope. Effectuer des mesures avec un microscope à fluorescence de grand champ à grande vitesse à l’aide d’un condenseur sur de longues distances et un 10 X (NA 0,3) objectif à immersion d’eau avec un monochromateur, un séparateur de faisceau et une caméra à dispositif à couplage de charge. Effectuer l’acquisition d’images et analyse avec système d’imagerie en temps réel. L’objectif de microscope au milieu de l’artère carotide à la surface de l’endothélium de l’accent. Injecter lentement 50 µL de l’acridine orange (0,5 mg/mL) (prendre en compte le volume mort du cathéter pour la première injection). Configurez le logiciel pour enregistrer des 100 images avec un temps de pose de 120 millisecondes par image. Faire quatre vidéos par l’artère carotide (gauche et droite) à différents endroits sur l’artère pour chaque vidéo. Si le signal de fluorescence diminue, injecter un autre 50 µL de l’acridine orange. Après l’enregistrement de toutes les vidéos euthanasier l’animal par dislocation cervicale. Réglez la vitesse vidéo à 10 images par seconde et quantifier les cellules roulants et des adhérents dans une vue de rectangle de µm de 200µm x 250 placé au milieu du navire pour chaque vidéo. Compter les cellules roulants et adhérentes ; les cellules adhérentes sont définies comme des cellules qui ne pas se déplacer ou se détacher de l’endothélium dans les 10 s vidéo. Pour simplifier la quantification, supprimer le canal avec la fluorescence rouge et utiliser seulement la fluorescence verte pour compter les cellules roulants et adhérentes. Pour les expériences utilisant l’acridine orange, faire un seuil manuels de la fluorescence afin d’éliminer l’information produite par les cellules endothéliales.