Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar
Summary
Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.
Abstract
Epifluorescence intravital video mikroskobu (IVM) kan damarlarının bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve rol için yeteneklerini değerlendirmek ve endotel katmana bağlı kurulan bir yöntemdir. Hücreleri floresan boyalar veya fluorophore birleştiğinde antikorlar enjeksiyonu ile dolaşan görselleştirme yaygın olarak kullanılır. Alternatif olarak, floresan muhabir fare-ebilmek var olmak kullanılmış. + (LysM+) etkileşimleri lökositlerin, belirli lizozim M monosit, gemi duvar ile vasküler disfonksiyon ve arteriyel hipertansiyon desteklenmesinde önemli rolleri oynamak. Burada görselleştirmek ve haddeleme lökosit ve Anjiyotensin II (AngII) karotis arterlerde yapışma ölçmek için teknik mevcut-hipertansiyon farelerde IVM tarafından indüklenen.
Bir kateter implantasyonu vasküler duvar zarar ve değiştirilmiş kan hücresi yanıt-e doğru yol açar. Biz farklı enjeksiyon teknikleri ve bir LysMCre+IRG+ lökosit görselleştirmek için yönetim yolları göre fare ile kırmızı floresan protein yaygın ifade ve LysM yeşil flüoresan proteinin koşullu ifade + hücreleri. LysM+ hücre aktivasyonu, biz AngII fareler infüzyon çalışırdım içinde inişli çıkışlı ve yapışma lökositlerin endotel artar. Biz de akridin bir Şah kullanarak turuncu kateter enjekte veya doğrudan kuyruk damar ve miktarını karşılaştırıldığında haddeleme ve kalarak hücreleri. Şah kateter implantasyon başına haddeleme sayısı arttı ve yapışan LysM+ hücrelerde sham infüzyon-LysMCre+kontrollere göre IRG+ fare bulduk. Bu harekete geçirmek AngII-infüzyon farelerde artar. İlginçtir, akridin doğrudan kuyruk damar artış LysM+ turuncu hücre adezyon enjekte veya sahte-infüzyon farelerde haddeleme. Böylece vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.
Introduction
Arteriyel hipertansiyon kardiyovasküler hastalık ve ölüm riskini artırır ve ateroskleroz, koroner kalp hastalığı ve atardamar veya toplardamar thromboembolisms1gelişimini teşvik etmektedir. Hipertansiyon gelişimini çevresel, genetik, endokrin ve hemodinamik faktörlerin etkileşimi üzerinde bağlıdır. Şu anda, bağışıklık ve ilgili iltihap hipertansiyon2etyoloji içinde önemli bir rol oynamak için takdir edilmektedir.
Bağışıklık hücreleri arasında T lenfositler yanı sıra monosit ve makrofajlar AngII kaynaklı damar iltihabı ve hipertansiyon, kısmen Reaktif oksijen türleri3tetiklemek için yeteneklerini ilgili nedensel dahil olmak bulundu. Makrofaj koloni uyarıcı faktör eksik fareler kan basıncı artışı ve damar iltihabı4ile ilgili AngII için azaltılmış tepki gösterdi. Bir önceki çalışmada, LysM + monosit vasküler disfonksiyon ve iltihap AngII kaynaklı hipertansiyon5‘ te sürücü gösterebilirim. Daha yakın zamanlarda, açıkladığımız bir roman yol hangi koagülasyon faktör XI trombosit ve Trombin bağlı damar iltihabı6ikna etmek için damar duvarı ile işbirliği yapmaktadır. Hipertansiyon bağışıklık sisteminde rol hakkında güncel bilgi son zamanlarda özetledi ve Rodriguez-Iturbe ve arktarafından incelendi. 7
Bağışıklık hücreleri hipertansiyon gelişiminde katılımı oldu beri modelleri ve teknikleri gemi ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için gerekli oldu. Epifluorescence IVM kan damarlarının dolaşan kan hücreleri ve endotel8,9,10arasında vivo içinde etkileşim gözlemlemek için yararlı bir araçtır. Bu teknik ile DNA’sını (akridin turuncu gibi) enterkalasyon boyalar enjeksiyon çekirdekli hücreler (dolaşımdaki yanı sıra endotel) görselleştirebilirsiniz. İzole trombosit ex vivo ile rhodamin – 6 G lekeli veya dichlorofluorescein (DCF) trombosit açısından zengin trombüsü atardamar veya toplardamar yaralanma modellerinde görselleştirmek için enjekte edilebilir.
Genellikle, juguler ven kateteri izleyiciler enjekte için kullanılan veya işaretli trombosit. Endotel İLETİMLERİNİZE ve koagülasyon cascade, sonraki harekete geçirmek her ikisi de bilinmektedir monosit etkinleştirme üzerinde etkiler. Endotel hasarı hemen trombosit harekete geçirmek subendothelial matris molekülleri takip eden monosit cazibe ve harekete geçirmek11ile doku mühür yol açar. Aksine, bir sağlam endotel antikoagülan özellikleri (Örneğin, doku faktörü yolu inhibitörü veya thrombomodulin yoluyla)12 ve monosit, örneğin, üzerinden salgılanmasını üzerinde doğrudan inhibitör etkileri olduğu bilinmektedir hücre dışı veziküller mikroRNA’lar13içeren. Monosit bir doku faktörü, koagülasyon cascade ve Trombin tarafından etkinleştirilebilir ve monosit harekete geçirmek14‘ te,15 katılmak hızlı proteaz aktif reseptörleri (PARs) dışsal aktivatör üretmek bilinmektedir . Bu nedenle, herhangi bir etkinleştirme trombosit veya vasküler yaralanma nedeniyle koagülasyon cascade olabilir monosit etkinleştirme üzerinde beklenmeyen etkileri ve gözlenen fenomen ile müdahale. LysM+ bir kateter ve alternatif yöntemleri ile enjeksiyonlar etkisi ayrıntılı olarak incelemek önerdiğimiz IRG transgenik LysM Cre transgenik fareler, bir çift-floresan Cre muhabir fare (LysMCre+IRG+) sayesinde, myelomonocytic hücreleri, arteriyel hipertansiyon16bir fare modeli.
Protocol
Representative Results
Discussion
LysM+ monosit daha önce hipertansiyon5gelişiminde karıştığı gösterilmiştir. İşte LysM+ bağışıklık hücreleri rulo ve yanıt AngII infüzyon olarak endotel katmanı uygun göstermektedir. Bu bulgu LysMCre+IRG+ kullanarak elde edildi fareler hipertansiyon vivo içinde bağışıklık hücrelerinin rolü lökosit enjeksiyon akridin turuncu6,10ile görselleştirme tarafından keşfetmek bizim önceki çalışmalar. Böylece, ayrımcılık kalarak için endotel hücre tiplerinin mümkün değildi.
IVM damar çalışmalar ve in vivo gözlemler damarlara doğrudan hücre için çok yararlı bir araçtır, ancak hipertansiyon inflamatuar bağlamında cerrahi olarak eklenen bir kateter yardımıyla boya enjekte etkisi bilinmeyen kalır. Kateter ve akridin turuncu potansiyel etkisini değerlendirmek için enjeksiyon biz IRG+ fareler LysMCre+avantajı aldı. AngII infüzyon sayısı arttı LysM+ hücreler endotel için inişli çıkışlı. Bir kateter juguler ven içine ekleme etkisi güçlendirilmiş ve daha haddeleme ve yapışan lökosit kateter implantlar olmadan fareler karşılaştırıldığında bir kateter ile Enstrümante AngII-infüzyon farelerde tespit edildi. Bu o implantasyonu bağlamında, sistemik inflamatuar reaksiyon kaplayan hipertansiyon18‘ görülen bağışıklık reaksiyonu ile yaranın Karotid kateter nedenleri gösterir. Buna ek olarak, juguler ven şahdamarını için yakınlık nedeniyle ek bir bağışıklık etkinleştirme juguler ven etkileyen tarafından oluşmuş olabilir. Bu etkinin ne zaman iğne kuyruğu damar içine yapılan mevcut değildi beri biz etkisi nedeniyle varsayabiliriz boya ama kateter ekleme yordamı değil. Biz burada in vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.
Bir kritik yordam AngII infüzyon adımdır. Kuyruk manşet değerlendirme kan basıncı AngII teslim etkinliğini denetlemek için pompa tarafından yapılabilir. Kan basıncı infüzyon 2−3 gün sonra artırmalıdır. LysM+ hücreleri harekete geçirmek etkileyen enflamasyon sınırlamak için nerede pompa implante kesi kapatılması dikiş yerine klipleri ile yapılmalıdır. Bir sınırlama kuyruk ven enjeksiyon hakkında kaydetti: en iyi olası veri toplama yapmak için 4 video genellikle her şahdamarı için alınır. Floresan sinyal azalırsa, akridin Orange 50 µL enjekte ama kuyruk enjeksiyon ile birkaç iğne yapmak ve şahdamarı mikroskop objektif altında sabit tutmak için daha zor. Juguler ven bir kateter varlığı süresi 4 saat sonra kateter implantasyon19hazırlanan trombosit açısından zengin plazma koagülasyon aktivasyonu etkiliyor bu yana, bağışıklık hücreleri harekete geçirmek de modüle. Kateter implantasyon bu yönünü daha fazla araştırma gerekiyor.
Bile LysM+ hücre aktivasyonu AngII infüzyon sonra Şah kateter Uygulanılmasından etkisini takdir ediyoruz, son olarak, biz tam olarak hazırlık, cilt temizleme ve potansiyel bir LysM+ hücre üzerinde karotis yalıtım rolü tahmin olamaz harekete geçirmek. Biz Floresans muhabir fare kullanımı böyle sonucuna LysMCre+IRG+ fare gemi bütünlük bozulma vivo içinde görüntüleme için hayvan hazırlık sırasında önlemek için tavsiye edilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser eğitim ve araştırma (BMBF 01EO1003 ve BMBF 01EO1503) için Almanca bakanlık tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
References
- Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
- Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
- Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
- De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
- Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
- Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
- Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
- Hinsbergh, V. W. Endothelium–role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
- Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
- Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
- Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes–role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
- Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. , (2017).
