Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Experimentos se realizaron en la edad de ratones machos 8 a 12 semanas de edad bajo la aprobación de la Comisión de ética de experimentación animal de Renania-Palatinado (número de autorización de 23 177-07/G12-1-002 y 23 177-07/G15-1-051). 1. anestesia y cirugía preparación del ratón Antes de la cirugía, verificar la buena salud y condición de los animales. Antes de la cirugía, seguimiento de animales una vez al día durante 2-3 días por su estado general (aspecto, postura, comportamiento espontáneo) y peso corporal, alimentos, consumo de agua. Preparación la mezcla principal para anestesia con midazolam (5 mg/kg de peso corporal), medetomidina (0.5 mg/kg de peso corporal) y fentanilo (0,05 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal (i.p.) inyectar 200 ratón μL/30 g en jeringa de 1 mL con una aguja de 26 G. Implantación de bomba osmótica y preparación de animales para experimentos IVM se realizan en un campo de operación con un 39 ° C calentamiento plataforma. Todas las herramientas en un baño de desinfección de esterilizar y para desinfectar la plataforma de calentamiento. Durante los procedimientos, proteger los ojos del animal con ungüento oftálmico. Quitar la piel con cuchillas de afeitar antes de la implantación de bomba osmótica. Usar hisopos de algodón y una crema de depilación para el aislamiento de carótidas y la implantación del catéter yugular en experimentos IVM. Desinfectar la piel de un animal mediante dos desinfectantes de la piel: un antiséptico y desinfectante con yodo povidona y una piel octenidine antiséptico que contiene en solución basada en alcohol. Preparar la mezcla principal para antagonizar la anestesia (“mix antisedan”) con atipamezol (0,05 mg/kg de peso corporal) y el flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) y preparar 200 μL/ratón en jeringa de 1 mL con una aguja de 26 G que por vía subcutánea (s.c.) inyectado. 2. implantación y preparación de la bomba osmótico Nota: La infusión subcutánea de AngII usando una bomba osmótica fue descrita en detalle por Lu et al. 17 Preparar la AngII por reconstituir el liofilizado con solución salina estéril y ajustar la concentración con el peso de los animales y el caudal de la bomba. Mantenga la AngII reconstituido en tubos de plástico (no usar tubos de vidrio). Llene las bombas con la solución de AngII para entregar 1 mg/(kg·d) por 7 días. Después de la preparación, mantener las bombas en solución salina estéril para 4-6 h mínimo a 37 ° C. Prueba de la anestesia completa del ratón después de la inyección de la mezcla de anestesia con posterior reflejos del pie y coloque en el campo de operación caliente. Inducción de la anestesia tarda 10-15 minutos y funciona mejor si los animales son colocados en un ambiente oscuro. Afeitarse la parte trasera del ratón inferior y desinfectar con una antiséptico la piel alcohólica. Haga una incisión de 1 cm perpendicular a la espina dorsal con unas tijeras. Crear un bolsillo para la bomba con una pinza hemostática estrecha e insertar la bomba (flujo moderador primero). El bolsillo debe permitir el movimiento libre de la bomba sin presión sobre la herida. Cerrar la herida con suturas y no clips, para limitar la inflamación; luego desinfectar con antiséptico la piel. Antagonizar la anestesia por inyección s.c. de 200 μL de la mezcla de antisedan y retomar el ratón de su jaula. Realizar analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) una vez después de la cirugía y en la demanda según el comportamiento de los animales. 3. implantación de catéter yugulares y carótidas preparación Prueba de la anestesia completa del ratón después de la inyección de la anestesia se mezclan con reflejos de alimentación posterior y colocar el animal anestesiado en postración dorsal en la placa quirúrgica de 39 ° C con una sonda rectal con el fin de mantener la temperatura y poner el ungüento sobre los ojos para protegerlos durante el procedimiento. Quite los pelos del cuello con la crema depilatoria. Utilice un hisopo de algodón y frotar la crema por 2 minutos hasta que los pelos empiezan a caer. Después de un adicional 2 minutos, retire la crema y los pelos con una espátula y desinfectar la piel con una antiséptico la piel alcohólica. Realizar la cirugía bajo un estereomicroscopio. Hacer una incisión de 1-1.5 cm de largo en la piel longitudinalmente en la nuca, 1 cm al lado de la tráquea. Luego realizar dos otras incisiones perpendicular a ambas extremidades de las incisiones de la primera. Retirar los tejidos la piel cuidadosamente y retire el pedazo de piel que cubre la izquierda de la vena yugular y la tráquea. Aislar cuidadosamente la glándula parótida; glándulas sublinguales y submaxilares de la zona de interés con 2 pinzas curvas. No cortar o dañar las glándulas, lugar para permitir el mejor acceso a la vena yugular y a las carótidas. Para aislar la vena yugular, usar pinzas finas y lentamente abrir y cerrarlo para liberar suavemente el vaso de los tejidos circundantes. Una vez que la vena esté completamente limpia, coloque la pinza debajo de la embarcación y dos suturas 7-0 de 10 cm debajo de él. Cerca de la sutura proximal a la cabeza con dos nudos. En la otra sutura, preparar un nudo pero no la cierre. Mantenga el catéter (0,28 mm diámetro, diámetro externo de 0,61 mm interior) llenado de 37 ° C solución salina estéril con pinza de un lado; mientras con la otra mano, haga una pequeña incisión en el recipiente con una tijera fina o una aguja de 26 G curvado. Luego inserte el catéter en la vena yugular y cierre el nudo dos veces. Cerca de la sutura proximal a la cabeza sobre el catéter para asegurar la inmovilización completa. Para aislar y preparar las arterias carótidas, disecar el área que cubre la tráquea usando fórceps curvo fino. Una vez libres de los tejidos circundantes los carotids, quitar el nervio de nervio vago (se ve como una línea blanca junto a la carótida) del recipiente (pero no la corte). El fórceps fino puede ser cerrado y abrió lentamente para movilizar suavemente el nervio. Una vez que ambas arterias son completamente limpios, coloque la pinza debajo de la primera arteria carótida y un trozo plástico pequeño negro 3 mm ancho x 2,5 cm longitud bajo el buque. Es muy importante no sobrecargar el recipiente y comprobar que el flujo de sangre está presente una vez que se coloca el soporte del recipiente. Coloque la segunda arteria sobre el titular del buque. Si el ratón no se coloca directamente bajo el microscopio, vuelva a colocar las glándulas sobre la tráquea y aplicar solución salina estéril de 37 ° C para evitar la sequedad de la zona. 4. evaluación de Rolling y la adhesión de leucocitos / LysM + células con IVM Preparación de una solución 2 mg/mL almacenada a-20 ° C naranja de acridina y diluirlo 1:4 en solución salina estéril (concentración final de 0,5 mg/mL) en jeringa de 1 mL.Proteger la jeringa de la luz y utilizar 200 μL por un ratón. Diferentes condiciones de prueba: (1) inyección de acridina naranja con el catéter yugular; (2) inyección de naranja de acridina directamente en la vena lateral de la cola (con esta condición que no se implantó catéter yugular); (3) medición sin ratones utilizando la fluorescencia LysMCre++ de IRG naranja de acridina (aquí de nuevo no se implantó catéter yugular). Una vez que el catéter está en el lugar y las dos carótidas están aislados, coloque el ratón en el microscopio. Realizar mediciones con un microscopio de fluorescencia de campo amplio alta velocidad usando un condensador de larga distancia y una 10 X (NA 0.3) objetivo de inmersión de agua con un monocromador, un divisor de haz y una cámara de dispositivo de carga acoplada. Realizar análisis con sistema de proyección de imagen en tiempo real y adquisición de la imagen. Enfocar el objetivo del microscopio en el centro de la arteria carótida en la superficie del endotelio. Lentamente inyectar 50 μl de naranja de acridina (0.5 mg/mL) (tomar en cuenta el volumen muerto del catéter para la primera inyección). Configure el software para grabación de 100 imágenes con un tiempo de exposición de 120 milisegundos por imagen. Hacer cuatro videos por la arteria carótida (izquierda y derecha) en diversas localizaciones en la arteria para cada vídeo. Si la señal de fluorescencia disminuye, inyectar otro 50 μl de naranja de acridina. Después de grabar todos los videos eutanasia a los animales por dislocación cervical. Ajustar la velocidad del video en 10 imágenes por segundo y cuantificar las células balanceo y adherentes μm 200 μm x 250 rectángulo vistas en medio de la embarcación para cada vídeo. Contar las células adherentes y ondulantes; las células adherentes se definen como células que no mueva ni desprenderse del endotelio dentro de los 10 s de vídeo. Para simplificar la cuantificación, quitar el canal con la fluorescencia roja y use sólo la fluorescencia verde para contar las células adherentes y ondulantes. Para los experimentos utilizando naranja de acridina, hacer un umbral manual de la fluorescencia para quitar fondo de las células endoteliales.