Infezione del Virus di Zika delle cellule staminali neurali del cervello fetale umano colto per analisi Immunocytochemical

Virus di Zika (ZIKV) è un flavivirus trasmesso sessualmente, oppure le zanzare zanzara Aedes aegypti e Aedes albopictus di vettori. ZIKV recentemente è stato identificato come una minaccia grave di salute pubblica grazie alla sua facilità di trasmissione e affiliati sintomi neurologici¹. Uno dei più riguardo agli effetti neurologici è lo sviluppo di microcefalia nei feti nati da madri infette incinta^2,3. La microcefalia è un disordine neurodevelopmental dove la testa è più piccola della dimensione tipica durante lo sviluppo fetale e alla nascita, con la circonferenza inferiore a 2 deviazioni standard sotto la media⁴. La circonferenza della testa più piccola è comunemente accompagnata da una varietà di comorbidità quali ritardi di sviluppo, convulsioni, visione e perdita dell’udito e difficoltà di alimentazione.

Recenti studi hanno utilizzato modelli animali o indotta da cellule staminali pluripotenti per studiare l’effetto dell’infezione di ZIKV sul neurosviluppo^5,6,7,8. Mentre questi studi hanno contribuito alla nostra conoscenza di ZIKV, l’uso di specie diverse o cellule geneticamente modificate potrebbero richiedere molto tempo e/o aggiungere ulteriori variabili che possono confondere l’effetto di ZIKV su lo sviluppo neurale cellule^{5, 6 , 7 , 8}. Tuttavia, la difficoltà di HSNC, in particolare la cultura non aderenti neurosphere descritto in questo protocollo, è che la cultura è molto sensibile ai metodi utilizzati per condurre la cultura⁹. Qualsiasi cambiamento nelle componenti medi, o anche la gestione fisica della nave cultura, è abbastanza per suscitare una reazione dai cellule⁹. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato una cultura in vitro umano fetale cervello-derivato delle cellule staminali neurali (hNSCs) per interrogare meccanicistico l’effetto di ZIKV sulle cellule staminali neurali fetali. Utilizzando il nostro metodo, hNSCs sono stati mantenuti per più di 80 passaggi senza apparenti cambiamenti fenotipici¹⁰. Inoltre, alterazioni cromosomiche come la trisomia erano entrambi nessuno o minimo¹¹. Questa cultura di HSNC si sviluppa come una cultura neurosphere non aderente. Uno dei vantaggi di neurosfere è che le sfere creano una nicchia ambientale unica nella cultura che è più riflettente di nicchie in vivo rispetto a culture bidimensionale⁹. Un altro vantaggio di questo protocollo è che più tipi di cellule possono essere derivati dalla cultura HSNC, consentendo un investigatore per osservare l’impatto di una determinata variabile HSNC sopravvivenza e differenziamento. Questo protocollo è applicabile alle persone in cerca di rispondere a meccanicistiche domande riguardanti lo sviluppo del sistema nervoso centrale o disfunzione. Il seguente protocollo descrive come espandere una cultura HSNC per infettare con ZIKV e successivamente differenziare il hNSCs per osservare l’impatto dell’infezione sul processo di differenziazione. Include anche metodi per memorizzare hNSCs per uso a lungo termine e hNSCs si differenziano in vari tipi di neuroni che consentono un ulteriore indagine di deficit indotti da ZIKV contribuendo al cervello malformazione¹¹. Crediamo che questo protocollo è anche di interesse per gli investigatori che cercano di comprendere l’impatto di qualsiasi stimolo ambientale quali l’infezione o tossine sulla sopravvivenza delle cellule staminali neurali e differenziazione.