Зика вирусной инфекции культурный человеческий мозг плода нервных стволовых клеток для иммуноцитохимическое анализа
Summary
Эта статья подробно описывает методы, которые используются для расширения человеческого мозга плода нервных стволовых клеток в культуре, а также как различать их в различные подтипы нейронов и астроциты, с упором на использование нервных стволовых клеток для изучения Зика вирусной инфекции.
Abstract
Человеческий мозг плода нервные стволовые клетки являются системы уникальный генетически модифицированных моделей для изучения влияния различных раздражителей на человеческого развития нейробиологии. Скорее, чем использовать модель животных или генетически модифицированных индуцированных плюрипотентных клеток, человеческие нервные стволовые клетки обеспечивают эффективный в vitro системы для изучения эффектов лечения, экран наркотиков, или изучить индивидуальные различия. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для методов, используемых для расширения человеческого мозга плода нервных стволовых клеток в культуре с сыворотки свободных СМИ, чтобы дифференцировать их в различные подтипы нейронов и астроциты через различные грунтовки процедур и заморозить и восстановить Эти клетки. Кроме того мы опишем процедуру использования человеческого мозга плода, нервные стволовые клетки для изучения Зика вирусной инфекции.
Introduction
Зика вирус (ZIKV) является flavivirus, передаваемых половым путем, либо комары Aedes aegypti и Aedes albopictus векторов комаров. ZIKV недавно была определена как угроза тяжелой общественного здравоохранения из-за его простота передачи и аффилированным неврологические симптомы1. Один из самых относительно неврологические эффекты является развитие микроцефалия в зародышах родился беременных ВИЧ-инфицированных матерей2,3. Микроцефалия является расстройство нервной, где меньше, чем типичный размер головы во время внутриутробного развития и при рождении, с окружностью, менее чем в 2 стандартных отклонения ниже среднего4. Меньше окружность головы обычно сопровождается целый ряд сопутствующих заболеваний, таких, как задержки в развитии, припадки, видение и потери слуха и кормление трудности.
Недавние исследования использовали Животные модели или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для изучения эффекта ZIKV инфекции на развитие нервной системы5,6,,78. Хотя эти исследования способствовали наши знания о ZIKV, использование различных видов или генетически модифицированные клетки может быть много времени и/или добавить дополнительные переменные, которые могут сбить с толку эффект ZIKV на развитие нервной клетки5, 6 , 7 , 8. Однако, трудности с НСК культуры, особенно культуры не сторонник нейросферы, описанных в настоящем Протоколе, является, что культура является очень чувствительной к методам, используемым для проведения культуры9. Любые изменения в средних компонентов, или даже физической обработки культуры судна, достаточно, чтобы вызвать реакцию клетки9. Для решения этих вопросов, мы разработали в vitro плода мозг производные нервных стволовых клеток человека (hNSCs) культуры механистически допросить влияние ZIKV на фетальных нервных стволовых клеток. С помощью нашего метода, hNSCs были сохранены для более чем 80 пассажи без очевидной фенотипические изменения10. Кроме того, хромосомные изменения, такие как трисомия были либо none или минимальным11. Эта культура НСК растет как non сторонник нейросферы культуры. Одним из преимуществ neurospheres является сферах создать уникальную нишу, экологической культуры, который более отражает в vivo ниш по сравнению с двумерной культур9. Еще одним преимуществом этого протокола является, что несколько типов клеток могут быть получены от НСК культуры, позволяя следователь наблюдать последствия данной переменной на НСК выживания и дифференциации. Этот протокол применяется для лиц, желающих ответить механистический вопросы, касающиеся развития центральной нервной системы или дисфункции. Следующий протокол описывает расширить культуру НСК заразить с ZIKV, и впоследствии дифференцировать hNSCs соблюдать воздействия инфекции на процесс дифференциации. Он также включает методы для хранения hNSCs для длительного использования и различать hNSCs в различные типы нейронов, которые позволяют дальнейшее расследование ZIKV-индуцированного дефицита, способствуя мозга мальформация11. Мы считаем, что этот протокол также представляет интерес для исследователей, стремящихся понять влияние каких-либо экологических стимулов такие инфекции или токсинов на выживание нервных стволовых клеток и дифференциации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность культуры и манипулировать hNSCs предоставляет важнейшим инструментом, который может использоваться для различных целей, от моделирования болезней человека для высокой пропускной способности наркотиков скрининг10,11,12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средств от Джон S. Dunn фонда и института для человека инфекции и иммунитет университета Техаса Медицинское отделение (P.W.).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
