In dit artikel een overzicht van de methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur, evenals hoe om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten, met de nadruk op het gebruik van neurale stamcellen te bestuderen Zika virusinfectie.
Menselijke foetale hersenen neurale stamcellen vormen een uniek model van niet-genetisch gemodificeerde systeem te bestuderen van de impact van verschillende stimuli op menselijke developmental neurobiologie. Eerder dan een dierlijk model of genetisch gemodificeerde geïnduceerde pluripotente cellen gebruikt, bieden menselijke neurale stamcellen een effectieve in vitro -systeem om te onderzoeken wat de gevolgen van behandelingen, scherm drugs, of het onderzoeken van individuele verschillen. Hier bieden wij de gedetailleerde protocollen voor methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur met serum-vrije media, om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten via verschillende priming procedures, en om te bevriezen en herstellen deze cellen. Daarnaast beschrijven we een procedure van het gebruik van neurale stamcellen van menselijke foetale hersenen te bestuderen Zika virusinfectie.
Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus of seksueel, en door de mug vectoren Aedes aegypti en Aedes albopictus muggen. ZIKV onlangs werd geïdentificeerd als een bedreiging van de volksgezondheid ernstig te wijten aan het gemak van transmissie en neurologische symptomen1aangesloten. Een van de meest betreffende neurologische effecten is de ontwikkeling van microcefalie in foetussen geboren zwangere geïnfecteerde moeders2,3. Microcefalie is een neurologische aandoening waar het hoofd kleiner is dan de typische grootte tijdens de foetale ontwikkeling en bij de geboorte, met de omtrek van minder dan 2 standaarddeviaties onder de gemiddelde4. De kleinere hoofdomtrek gaat vaak gepaard met allerlei comorbidities zoals ontwikkelingsstoornissen vertragingen, toevallen, visie en gehoorverlies en voederen van moeilijkheid.
Recente studies hebben dierlijke modellen gebruikt of geïnduceerde pluripotente stamcellen te bestuderen van het effect van ZIKV besmetting van neurologische5,6,7,8. Terwijl deze studies hebben bijgedragen aan onze kennis van ZIKV, het gebruik van verschillende soorten of genetisch gemodificeerde cellen kunnen tijdrovend zijn en/of voeg extra variabelen die kunnen verwarren het effect van ZIKV op de ontwikkeling van neurale cellen5, 6 , 7 , 8. het probleem met de hNSC cultuur, met name de niet-aanhanger neurosphere beschreven in dit protocol is echter dat de cultuur zeer gevoelig voor de gebruikte methoden is voor het voeren van de cultuur-9. Wijzigingen in middelgrote componenten, of zelfs de fysieke verwerking van het vaartuig van de cultuur, is genoeg om het uitlokken van een reactie van de cellen9. Om deze kwesties te behandelen, ontwikkeld wij een cultuur van menselijke foetale hersenen-afgeleide neurale stamcellen (hNSCs) in vitro te ondervragen mechanistically het effect van ZIKV op foetale neurale stamcellen. Met onze methode, werden hNSCs voor meer dan 80 passages zonder duidelijk fenotypische wijzigingen10onderhouden. Bovendien chromosomale wijzigingen zoals Trisomie waren ofwel geen of minimale11. Deze cultuur hNSC groeit als een niet-aanhanger neurosphere cultuur. Een voordeel van neurospheres is dat de sferen creëren een unieke ecologische niche in cultuur die is meer reflectie van in vivo niches in vergelijking met tweedimensionale culturen9. Een ander voordeel van dit protocol is dat meerdere celtypes kunnen worden afgeleid uit de hNSC-cultuur, waardoor een onderzoeker aan het observeren van de invloed van een bepaalde variabele op hNSC overleving en differentiatie. Dit protocol is van toepassing op personen die op zoek om mechanistische vragen met betrekking tot de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel of disfuncties te beantwoorden. Het volgende protocol wordt beschreven hoe een hNSC cultuur te infecteren met ZIKV, en vervolgens het onderscheiden van de hNSCs om te zien hoe de gevolgen van de besmetting van de differentiatie-proces uit te breiden. Het bevat ook methoden voor het opslaan van hNSCs voor langdurig gebruik, en om te onderscheiden hNSCs in verschillende soorten neuronen waarmee verder onderzoek naar ZIKV-geïnduceerde tekorten bij te dragen tot de hersenen malformatie11. Wij geloven dat dit protocol is eveneens van belang aan onderzoekers willen begrijpen de impact van eventuele milieu stimulus zoals infectie of toxine op neurale stamcellen overleving en differentiatie.
De mogelijkheid om cultuur en manipuleren van hNSCs biedt een kritische tool die worden voor allerlei doeleinden gebruikt kan van het modelleren van ziekten bij de mens aan hoge doorvoer drug screening van10,11,12,14, 15,16,17. Veel vragen worden aangepakt zoals hoe menselijke foetale herse…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door fondsen van de John S. Dunn Foundation en het Instituut voor menselijke besmettingen en immuniteit van de Universiteit van Texas Medical Branch (PW).
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
Insulin | Sigma | I4011 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Transferrin | Sigma | T2036 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |