Summary

Zika Virus infectie van gekweekte menselijke foetale hersenen neurale stamcellen immunocytochemische p.a.

Published: February 05, 2018
doi:

Summary

In dit artikel een overzicht van de methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur, evenals hoe om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten, met de nadruk op het gebruik van neurale stamcellen te bestuderen Zika virusinfectie.

Abstract

Menselijke foetale hersenen neurale stamcellen vormen een uniek model van niet-genetisch gemodificeerde systeem te bestuderen van de impact van verschillende stimuli op menselijke developmental neurobiologie. Eerder dan een dierlijk model of genetisch gemodificeerde geïnduceerde pluripotente cellen gebruikt, bieden menselijke neurale stamcellen een effectieve in vitro -systeem om te onderzoeken wat de gevolgen van behandelingen, scherm drugs, of het onderzoeken van individuele verschillen. Hier bieden wij de gedetailleerde protocollen voor methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur met serum-vrije media, om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten via verschillende priming procedures, en om te bevriezen en herstellen deze cellen. Daarnaast beschrijven we een procedure van het gebruik van neurale stamcellen van menselijke foetale hersenen te bestuderen Zika virusinfectie.

Introduction

Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus of seksueel, en door de mug vectoren Aedes aegypti en Aedes albopictus muggen. ZIKV onlangs werd geïdentificeerd als een bedreiging van de volksgezondheid ernstig te wijten aan het gemak van transmissie en neurologische symptomen1aangesloten. Een van de meest betreffende neurologische effecten is de ontwikkeling van microcefalie in foetussen geboren zwangere geïnfecteerde moeders2,3. Microcefalie is een neurologische aandoening waar het hoofd kleiner is dan de typische grootte tijdens de foetale ontwikkeling en bij de geboorte, met de omtrek van minder dan 2 standaarddeviaties onder de gemiddelde4. De kleinere hoofdomtrek gaat vaak gepaard met allerlei comorbidities zoals ontwikkelingsstoornissen vertragingen, toevallen, visie en gehoorverlies en voederen van moeilijkheid.

Recente studies hebben dierlijke modellen gebruikt of geïnduceerde pluripotente stamcellen te bestuderen van het effect van ZIKV besmetting van neurologische5,6,7,8. Terwijl deze studies hebben bijgedragen aan onze kennis van ZIKV, het gebruik van verschillende soorten of genetisch gemodificeerde cellen kunnen tijdrovend zijn en/of voeg extra variabelen die kunnen verwarren het effect van ZIKV op de ontwikkeling van neurale cellen5, 6 , 7 , 8. het probleem met de hNSC cultuur, met name de niet-aanhanger neurosphere beschreven in dit protocol is echter dat de cultuur zeer gevoelig voor de gebruikte methoden is voor het voeren van de cultuur-9. Wijzigingen in middelgrote componenten, of zelfs de fysieke verwerking van het vaartuig van de cultuur, is genoeg om het uitlokken van een reactie van de cellen9. Om deze kwesties te behandelen, ontwikkeld wij een cultuur van menselijke foetale hersenen-afgeleide neurale stamcellen (hNSCs) in vitro te ondervragen mechanistically het effect van ZIKV op foetale neurale stamcellen. Met onze methode, werden hNSCs voor meer dan 80 passages zonder duidelijk fenotypische wijzigingen10onderhouden. Bovendien chromosomale wijzigingen zoals Trisomie waren ofwel geen of minimale11. Deze cultuur hNSC groeit als een niet-aanhanger neurosphere cultuur. Een voordeel van neurospheres is dat de sferen creëren een unieke ecologische niche in cultuur die is meer reflectie van in vivo niches in vergelijking met tweedimensionale culturen9. Een ander voordeel van dit protocol is dat meerdere celtypes kunnen worden afgeleid uit de hNSC-cultuur, waardoor een onderzoeker aan het observeren van de invloed van een bepaalde variabele op hNSC overleving en differentiatie. Dit protocol is van toepassing op personen die op zoek om mechanistische vragen met betrekking tot de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel of disfuncties te beantwoorden. Het volgende protocol wordt beschreven hoe een hNSC cultuur te infecteren met ZIKV, en vervolgens het onderscheiden van de hNSCs om te zien hoe de gevolgen van de besmetting van de differentiatie-proces uit te breiden. Het bevat ook methoden voor het opslaan van hNSCs voor langdurig gebruik, en om te onderscheiden hNSCs in verschillende soorten neuronen waarmee verder onderzoek naar ZIKV-geïnduceerde tekorten bij te dragen tot de hersenen malformatie11. Wij geloven dat dit protocol is eveneens van belang aan onderzoekers willen begrijpen de impact van eventuele milieu stimulus zoals infectie of toxine op neurale stamcellen overleving en differentiatie.

Protocol

Menselijke neurale stamcellen waren oorspronkelijk afgeleid van afgedankte menselijke foetale cortexes in het eerste trimester12. Alle procedures van het protocol voldoet aan de Universiteit van Texas Medical Branch ethische richtlijnen betreffende het gebruik van menselijk weefselmonsters, en de cellijnen werden goedgekeurd door de institutionele Commissie van de bioveiligheid. 1. middelgrote voorbereiding en stamcel herstel Bereiden kweekmedium voorraad (DFH…

Representative Results

Gekweekte hNSCs in hun proliferatieve fase zal groeien als niet-aanhanger neurospheres (Figuur 1). Onmiddellijk na hNSC passage, zal er veel individuele cellen, die zal aggregaat en begint te formulier bollen in de komende paar dagen (figuur 1A en 1B). Gezonde bollen moet ongeveer 1-2 mm diameter 9-10 dagen na een passage (Figuur 1 c). Bollen die groter zijn dan 2 mm groeien zal ontw…

Discussion

De mogelijkheid om cultuur en manipuleren van hNSCs biedt een kritische tool die worden voor allerlei doeleinden gebruikt kan van het modelleren van ziekten bij de mens aan hoge doorvoer drug screening van10,11,12,14, 15,16,17. Veel vragen worden aangepakt zoals hoe menselijke foetale herse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door fondsen van de John S. Dunn Foundation en het Instituut voor menselijke besmettingen en immuniteit van de Universiteit van Texas Medical Branch (PW).

Materials

DMEM Gibco 11965-092
F12 Gibco 11765-054
Glucose (10%) Sigma G8644
HEPES (1M) Corning/cellgro 25-060-c1
Pen Strep (100x) Gibco 15140-122
Insulin Sigma I4011
L-Glutamine Gibco 25030-081
Transferrin Sigma T2036
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
Heparin Sigma Sigma H3149
basic fibroblast growth factor R&D system 233-FB
epidermal growth factor R&D system 236-EG
leukemia inhibitory factor R&D system 7734-LF
Laminin Invitrogen 23017-015
2.5% trypsin Gibco 15090-046
Trypsin inhibitor Sigma T6522
Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) Sigma P6407-5MG
B-27 supplement Gibco/Invitrogen 17504-044
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ml
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning/cellgro 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma A4378-25G
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Lab 005-000-121
Triton X-100 FisherBiotech BP151-500
Nestin antibody BD Transduction Laboratories 611659 1:200 dilution
Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) Covnce MMS-435p 1:2000 dulution
GFAP antibody Millipore AB5804 1:1000 dilution
DAPI Molecular Probes D1306 1:2000 dilution
ZIKV antibody World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch 1:2000 dilution
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
CO2 incubator Thermo Forma Model# 3110
Centrifuge Thermo fisher Scientific 75004221
Biological safety cabinet Forma scientific Claas II A/B3 Model# 1284
Freezer (-80 °C) Forma scientific,Inc model# 8516
Microscope(phase contrast image) Hp 2230 workstation Product#NOE25us#ABA
Microscope (epifluorescent image) Nikon Eclipse 80i
Confocal Microscope Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
  2. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
  3. Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
  4. Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
  5. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  6. Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
  7. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
  8. Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
  9. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  10. Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
  11. McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
  12. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  13. Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
  14. Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
  15. Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
  16. Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
  17. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).

Play Video

Cite This Article
McGrath, E. L., Gao, J., Wu, P. Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (132), e56917, doi:10.3791/56917 (2018).

View Video