العدوى بفيروس زكى من الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري مثقف لتحليل إيمونوسيتوتشيميكال
Summary
هذه المادة تفاصيل الأساليب التي يتم استخدامها لتوسيع نطاق الخلايا الجذعية العصبية الدماغ الجنين البشري في الثقافة، فضلا عن كيفية التفريق بينها في مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية وأستروسيتيس، مع تركيز على استخدام الخلايا الجذعية العصبية لدراسة زكى الإصابة بعدوى الفيروس.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري نظام نموذج فريد غير معدلة وراثيا لدراسة تأثير المحفزات المختلفة في بيولوجيا الأعصاب التنموية البشرية. بدلاً من استخدام نموذج حيوان أو الخلايا المحورة وراثيا المستحثة pluripotent، الخلايا الجذعية العصبية البشرية توفير نظام فعال في المختبر دراسة آثار المعالجات، المخدرات الشاشة، أو دراسة الفروق الفردية. هنا، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة للأساليب المستخدمة لتوسيع نطاق الخلايا الجذعية العصبية الدماغ الجنين البشري في الثقافة مع وسائل الإعلام خالية من المصل، إلى التفريق بينهم في مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية وأستروسيتيس عن طريق إجراءات فتيلة مختلفة، وإلى تجميد واسترداد هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يصف لنا إجراء استخدام الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري لدراسة زكى الإصابة بعدوى الفيروس.
Introduction
فيروس زكى (زيكف) مصفر إرسالها أما جنسياً، أو بواسطة البعوض Aedes albopictus و بعوض الزاعجة المصرية نواقل البعوض. زيكف قد حددت مؤخرا كتهديد صحة العامة شديدة بسبب سهولة انتقال وأعراض عصبية1. واحدة من الأكثر فيما يتعلق بالتأثيرات العصبية هو تطوير صغر الرأس في الأجنة يولدون للأمهات الحوامل المصابات بالفيروس2،3. صعل اضطرابات النمائية حيث الرأس أصغر من حجم نموذجي أثناء تطوير الجنين وعند الولادة، مع المحيط أقل من 2 انحراف معياري أقل من متوسط4. ويرافق محيط الرأس أصغر عادة مجموعة متنوعة من كانوا مثل تأخر النمو والمضبوطات والرؤية والسمع والتغذية صعوبة.
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد استخدمت نماذج حيوانية أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent لدراسة تأثير الإصابة زيكف على النماء العصبي5،6،،من78. في حين أن هذه الدراسات قد ساهمت في معرفتنا زيكف، استخدام الأنواع المختلفة أو الخلايا المحورة وراثيا قد يكون مضيعة للوقت و/أو إضافة المتغيرات الإضافية التي قد يتيه تأثير زيكف على وضع العصبية الخلايا5، 6 , 7 , 8-ومع ذلك، الصعوبة مع الثقافة واﻻتفاقية، ولا سيما الثقافة غير ملتصقة نيوروسفيري المبينة في هذا البروتوكول، أن الثقافة حساسة للغاية للأساليب المستخدمة لإجراء الثقافة9. أي تغيير في مكونات المتوسطة، أو حتى التعامل مع السفينة، والثقافة المادية ما يكفي للحصول على رد فعل من9خلايا. ولمعالجة هذه المسائل، قمنا بتطوير ثقافة بشرية الجنينية المستمدة من الدماغ العصبية خلايا الجذعية (هنسكس) في المختبر استجواب ميتشانيستيكالي أثر زيكف على الخلايا الجذعية الجنينية العصبية. استخدام أسلوب لدينا، أبقى هنسكس لما يزيد على 80 من الممرات دون التغيرات المظهرية الظاهر10. وعلاوة على ذلك، كانت التعديلات الصبغية مثل تريسمي أما بلا أو الحد الأدنى11. هذه الثقافة واﻻتفاقية ينمو كثقافة نيوروسفيري غير ملتصقة. ميزة واحدة من نيوروسفيريس هو أن المجالات إنشاء مكانة بيئية فريدة من نوعها في الثقافة التي تتجلى أكثر في فيفو الكوّات مقارنة بالثقافات ثنائي الأبعاد9. وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أن العديد من أنواع الخلايا يمكن أن يستمد من ثقافة واﻻتفاقية، تمكين محقق لمراقبة تأثير متغير معطى على بقاء واﻻتفاقية والتمايز. هذا البروتوكول لا ينطبق على الأفراد تتطلع إلى الإجابة على الأسئلة آليا فيما يتعلق بتطوير الجهاز العصبي المركزي أو خلل وظيفي. البروتوكول التالية توضح كيفية توسيع ثقافة واﻻتفاقية تصيب مع زيكف، وبعد ذلك التفريق بين هنسكس لمراقبة تأثير الإصابة على عملية المفاضلة. ويشمل أيضا أساليب لتخزين هنسكس للاستخدام طويل الأجل، والتمييز بين هنسكس إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التي تسمح لمواصلة التحقيق في حالات العجز الناجمة عن زيكف المساهمة في الدماغ تشوه11. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول أيضا من مصلحة المحققين السعي إلى فهم الأثر المترتب على أي حافز البيئية مثل العدوى أو السموم على بقاء الخلايا الجذعية العصبية والتمايز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر القدرة على الثقافة والتلاعب هنسكس أداة بالغة الأهمية التي يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الأغراض من نمذجة الأمراض البشرية للمخدرات إنتاجية عالية فحص10،11،،من1214، 15،،من16</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل أموال من مؤسسة جون س. دن ومعهد الإصابات البشرية والحصانة من فرع جامعة تكساس الطبية (الأسبق).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
