Summary

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Published: February 05, 2018
doi:

Summary

מאמר זה מפרט את שיטות המשמשות כדי להרחיב את תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי תרבות, כמו גם כיצד להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים, תוך שימת דגש על השימוש בתאי גזע עצביים ללמוד Zika בנגיף.

Abstract

תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי מהווים מערכת מודל ייחודי שאינו-מהונדסים לחקור את ההשפעה של גירויים שונים על האדם הנוירו-ביולוגיה התפתחותית. מעדיף מאשר להשתמש במודל חיה או תאים pluripotent המושרה מהונדסים, תאי גזע עצביים אנושי לספק מערכת יעילה במבחנה כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים, תרופות מסך, או לבחון הבדלים אינדיבידואליים. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקולים מפורט עבור שיטות המשמשות להרחבתן של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבות עם מדיה ללא סרום, כדי להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים באמצעות הליכים שונים לקרקע, כדי להקפיא ולשחזר תאים אלה. יתר על כן, אנו מתארים הליך של שימוש בתאי גזע עצביים במוח העובר האדם ללמוד Zika בנגיף.

Introduction

Zika וירוס (ZIKV) הוא flavivirus ששודרו או מינית, או על ידי יתוש וקטורים היתושים Aedes aegypti ו אדס מפוספס . ZIKV לאחרונה זוהה כאיום חמור לבריאות הציבור בשל הקלות של שידור, המזוהה עם סימפטומים נוירולוגיים1. ביותר לגבי תופעות נוירולוגיות היא התפתחות microcephaly ההתעסקות נולד האמהות נגועים בהריון2,3. Microcephaly היא הפרעה התפתחותיות איפה הראש הוא קטן יותר מהגודל טיפוסי במהלך התפתחות העובר, בלידה, עם ההיקף פחות מ- 2 סטיות תקן מתחת רשע4. היקף ראש קטן יותר מלווה בדרך כלל מגוון רחב של מחלות רקע כגון עיכובים התפתחותיים, התקפים, ראייה, אובדן שמיעה, האכלה קושי.

מחקרים שנעשו לאחרונה בשימוש בבעלי חיים או המושרה בתאי גזע pluripotent לחקור את ההשפעה של זיהום ZIKV neurodevelopment5,6,7,8. בעוד מחקרים אלה תרמו הידע שלנו על ZIKV, השימוש של מינים שונים או תאים מהונדסים עשויה לגזול זמן רב ו/או להוסיף משתנים נוספים אשר עשויים לבלבל את השפעת ZIKV על פיתוח עצבית תאים5, 6 , 7 , 8. עם זאת, הקושי עם תרבות hNSC, במיוחד את תרבות שאינם מחסידי neurosphere המתוארות פרוטוקול זה, היא כי התרבות היא רגישה מאוד שיטות השתמשו כדי לנהל את תרבות9. כל שינוי רכיבים בינונית, או אפילו את הטיפול הפיזי של כלי השיט תרבות, מספיקה כדי להפיק תגובה9תאים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו תרבות אנושית עוברית המוח-derived עצבית תאי גזע (hNSCs) במבחנה mechanistically לחקור את השפעת ZIKV על תאי גזע עצביים בעובר. באמצעות השיטה שלנו, hNSCs היו נשמרים עבור מעל 80 קטעים ללא שינויים פנוטיפי לכאורה10. יתר על כן, שינויים כרומוזומלית כגון טריזומיה היו גם או מינימלי11. תרבות זו hNSC גדל כתרבות שאינו חסיד neurosphere. אחד היתרונות של neurospheres הוא הכדורים ליצור נישה סביבתית ייחודית בתרבות זו משקפת יותר ויוו נישות לעומת מימדי התרבויות9. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי סוגי תאים מרובים הנגזרות התרבות hNSC, הפעלת חוקר לבחון את ההשפעה של משתנה נתון על הישרדות hNSC ובידול. פרוטוקול זה חל יחידים שמחפש תשובה מכניסטית שאלות לגבי התפתחות מערכת העצבים המרכזית או תפקוד לקוי. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להרחיב את תרבות hNSC להדביק עם ZIKV ולאחר מכן להבדיל את hNSCs כדי לבחון את ההשפעה של זיהום על תהליך התמיינות. זה כולל גם שיטות לאחסון hNSCs לשימוש ארוך טווח, וכדי להבדיל hNSCs לתוך סוגים שונים של נוירונים זה לאפשר את המשך החקירה של גירעונות ZIKV-induced תורם להפרת זכויות המוח11. אנו מאמינים שפרוטוקול זה הוא גם עניין חוקרים המבקשים להכיר את ההשפעה של כל גירוי סביבתיים כגון זיהום או רעלים על תאי גזע עצביים הישרדות ובידול.

Protocol

תאי גזע עצביים האנושי היו במקור נגזר זרוקים cortexes העובר האנושי השליש הראשון12. כל ההליכים פרוטוקול לדבוק ההנחיות אתיקה באוניברסיטת טקסס הענף הרפואי בנוגע לשימוש של דגימות רקמה אנושית, הקווים תא אושרו על-ידי הוועדה המוסדית אבטחה. 1. הכנה בינונית מניות ושחזור תאי גז…

Representative Results

HNSCs בתרבית בשלב המקדימות שלהם יגדל ככל שאינם מחסידי neurospheres (איור 1). מיד לאחר המעבר hNSC, יהיו הרבה תאים בודדים, אשר צבירה, להתחיל הספירות טופס בבימים הקרובים (איור 1A ו 1B). הספירות בריא צריך להיות כ 1-2 מ מ בקוטר של 9-10 ימים בעקבות מעבר (<stron…

Discussion

היכולת תרבות ולטפל hNSCs מספק כלי קריטי שיכול לשמש למגוון רחב של מטרות של מידול מחלות אנושיות לתרופה תפוקה גבוהה הקרנת10,11,12,14, 15,16,17. שאלות רבות נותרו יש לטפל כמו מו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי בכספי קרן ג’ון דאן ס ו המכון זיהומים האנושי חסינות של הענף הרפואי אוניברסיטת טקסס (פ. וו).

Materials

DMEM Gibco 11965-092
F12 Gibco 11765-054
Glucose (10%) Sigma G8644
HEPES (1M) Corning/cellgro 25-060-c1
Pen Strep (100x) Gibco 15140-122
Insulin Sigma I4011
L-Glutamine Gibco 25030-081
Transferrin Sigma T2036
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
Heparin Sigma Sigma H3149
basic fibroblast growth factor R&D system 233-FB
epidermal growth factor R&D system 236-EG
leukemia inhibitory factor R&D system 7734-LF
Laminin Invitrogen 23017-015
2.5% trypsin Gibco 15090-046
Trypsin inhibitor Sigma T6522
Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) Sigma P6407-5MG
B-27 supplement Gibco/Invitrogen 17504-044
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ml
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning/cellgro 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma A4378-25G
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Lab 005-000-121
Triton X-100 FisherBiotech BP151-500
Nestin antibody BD Transduction Laboratories 611659 1:200 dilution
Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) Covnce MMS-435p 1:2000 dulution
GFAP antibody Millipore AB5804 1:1000 dilution
DAPI Molecular Probes D1306 1:2000 dilution
ZIKV antibody World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch 1:2000 dilution
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
CO2 incubator Thermo Forma Model# 3110
Centrifuge Thermo fisher Scientific 75004221
Biological safety cabinet Forma scientific Claas II A/B3 Model# 1284
Freezer (-80 °C) Forma scientific,Inc model# 8516
Microscope(phase contrast image) Hp 2230 workstation Product#NOE25us#ABA
Microscope (epifluorescent image) Nikon Eclipse 80i
Confocal Microscope Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
  2. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
  3. Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
  4. Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
  5. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  6. Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
  7. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
  8. Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
  9. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  10. Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
  11. McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
  12. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  13. Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
  14. Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
  15. Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
  16. Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
  17. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).

Play Video

Cite This Article
McGrath, E. L., Gao, J., Wu, P. Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (132), e56917, doi:10.3791/56917 (2018).

View Video