זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical
Summary
מאמר זה מפרט את שיטות המשמשות כדי להרחיב את תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי תרבות, כמו גם כיצד להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים, תוך שימת דגש על השימוש בתאי גזע עצביים ללמוד Zika בנגיף.
Abstract
תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי מהווים מערכת מודל ייחודי שאינו-מהונדסים לחקור את ההשפעה של גירויים שונים על האדם הנוירו-ביולוגיה התפתחותית. מעדיף מאשר להשתמש במודל חיה או תאים pluripotent המושרה מהונדסים, תאי גזע עצביים אנושי לספק מערכת יעילה במבחנה כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים, תרופות מסך, או לבחון הבדלים אינדיבידואליים. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקולים מפורט עבור שיטות המשמשות להרחבתן של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבות עם מדיה ללא סרום, כדי להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים באמצעות הליכים שונים לקרקע, כדי להקפיא ולשחזר תאים אלה. יתר על כן, אנו מתארים הליך של שימוש בתאי גזע עצביים במוח העובר האדם ללמוד Zika בנגיף.
Introduction
Zika וירוס (ZIKV) הוא flavivirus ששודרו או מינית, או על ידי יתוש וקטורים היתושים Aedes aegypti ו אדס מפוספס . ZIKV לאחרונה זוהה כאיום חמור לבריאות הציבור בשל הקלות של שידור, המזוהה עם סימפטומים נוירולוגיים1. ביותר לגבי תופעות נוירולוגיות היא התפתחות microcephaly ההתעסקות נולד האמהות נגועים בהריון2,3. Microcephaly היא הפרעה התפתחותיות איפה הראש הוא קטן יותר מהגודל טיפוסי במהלך התפתחות העובר, בלידה, עם ההיקף פחות מ- 2 סטיות תקן מתחת רשע4. היקף ראש קטן יותר מלווה בדרך כלל מגוון רחב של מחלות רקע כגון עיכובים התפתחותיים, התקפים, ראייה, אובדן שמיעה, האכלה קושי.
מחקרים שנעשו לאחרונה בשימוש בבעלי חיים או המושרה בתאי גזע pluripotent לחקור את ההשפעה של זיהום ZIKV neurodevelopment5,6,7,8. בעוד מחקרים אלה תרמו הידע שלנו על ZIKV, השימוש של מינים שונים או תאים מהונדסים עשויה לגזול זמן רב ו/או להוסיף משתנים נוספים אשר עשויים לבלבל את השפעת ZIKV על פיתוח עצבית תאים5, 6 , 7 , 8. עם זאת, הקושי עם תרבות hNSC, במיוחד את תרבות שאינם מחסידי neurosphere המתוארות פרוטוקול זה, היא כי התרבות היא רגישה מאוד שיטות השתמשו כדי לנהל את תרבות9. כל שינוי רכיבים בינונית, או אפילו את הטיפול הפיזי של כלי השיט תרבות, מספיקה כדי להפיק תגובה9תאים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו תרבות אנושית עוברית המוח-derived עצבית תאי גזע (hNSCs) במבחנה mechanistically לחקור את השפעת ZIKV על תאי גזע עצביים בעובר. באמצעות השיטה שלנו, hNSCs היו נשמרים עבור מעל 80 קטעים ללא שינויים פנוטיפי לכאורה10. יתר על כן, שינויים כרומוזומלית כגון טריזומיה היו גם או מינימלי11. תרבות זו hNSC גדל כתרבות שאינו חסיד neurosphere. אחד היתרונות של neurospheres הוא הכדורים ליצור נישה סביבתית ייחודית בתרבות זו משקפת יותר ויוו נישות לעומת מימדי התרבויות9. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי סוגי תאים מרובים הנגזרות התרבות hNSC, הפעלת חוקר לבחון את ההשפעה של משתנה נתון על הישרדות hNSC ובידול. פרוטוקול זה חל יחידים שמחפש תשובה מכניסטית שאלות לגבי התפתחות מערכת העצבים המרכזית או תפקוד לקוי. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להרחיב את תרבות hNSC להדביק עם ZIKV ולאחר מכן להבדיל את hNSCs כדי לבחון את ההשפעה של זיהום על תהליך התמיינות. זה כולל גם שיטות לאחסון hNSCs לשימוש ארוך טווח, וכדי להבדיל hNSCs לתוך סוגים שונים של נוירונים זה לאפשר את המשך החקירה של גירעונות ZIKV-induced תורם להפרת זכויות המוח11. אנו מאמינים שפרוטוקול זה הוא גם עניין חוקרים המבקשים להכיר את ההשפעה של כל גירוי סביבתיים כגון זיהום או רעלים על תאי גזע עצביים הישרדות ובידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת תרבות ולטפל hNSCs מספק כלי קריטי שיכול לשמש למגוון רחב של מטרות של מידול מחלות אנושיות לתרופה תפוקה גבוהה הקרנת10,11,12,14, 15,16,17. שאלות רבות נותרו יש לטפל כמו מו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי בכספי קרן ג’ון דאן ס ו המכון זיהומים האנושי חסינות של הענף הרפואי אוניברסיטת טקסס (פ. וו).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
