Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

Transgeni:

Perché espressione di mCherry è stata migliorata attraverso l’inserimento di codone-ottimizzazione e introne (e più disponibile GCaMP giornalisti non hanno), iniettare ~ 4 volte la quantità di plasmide GCaMP5-esprimendo per assicurare livelli comparabili di fluorescenza GCaMP5 durante forte Ca ^{2 +} transitori. Salvataggio della mutazione lin-15(n765ts) consente il facile recupero di animali transgenici con effetti minimi sulla deposizione delle uova e altri comportamenti³⁵. Transgeni dovrebbero essere integrati per garantire espressione uniforme e condizioni tra diversi animali²⁵di imaging. Dovrebbe funzionare anche indicatori selezionabili compreso resistenza antibiotica^36,37 e salvataggio di armi letali termosensibile³⁸ , ma, poiché gli animali non transgenici sono morti, conferma di integrazione del transgene e l’omozigosi è più difficile rispetto ai marcatori che presentano un fenotipo visibile²⁵. Marcatori dominanti che interferire con normale locomozione e diminuiscono il fitness, quali rol-6(dm), dovrebbero essere evitato³⁹. Imaging in lite-1 sfondo mutante è essenziale per ridurre la luce blu fuga risposte durante imaging^23,40,41. Ulteriore mutazione del gur-3, che agisce in parallelo lite-1, può ridurre ulteriormente le residua comportamento e cambiamenti fisiologici causati da luce blu⁴². Convenientemente, gur-3, lite-1e lin-15 sono tutti situati nella metà destra del cromosoma X, che dovrebbe semplificare la costruzione di nuovi ceppi per Ca^{2 +} imaging e optogenetica esperimenti.

Poiché i tempi di esposizione sono brevi e vengono raccolte le immagini a 20 Hz, segnali GCaMP5 e mCherry devono essere brillanti. La spiegazione più probabile per rumoroso Ca^{2 +} le registrazioni è dim fluorescenza causata dall’espressione debole reporter. Promotori dovrebbero anche essere ragionevolmente specifici per la regione essere imaged. Perché il corpo cellulare HSN e sinapsi sui muscoli vulval sono al centro del corpo, espressione aggiuntiva dal promotore nlp-3 in testa e in coda è in genere di fuori del campo visivo e può essere escluso tramite filtri aggiuntivi nella Software di quantizzazione raziometrici. Per garantire che osservato cambiamenti nel risultato di fluorescenza di GCaMP5 da modifiche effettive in intracellulare di Ca^{2 +}, controllo transgeni che esprimono GFP invece di GCaMP5 devono essere preparato in modo indipendente e analizzato²⁶. Più recenti Ca^{2 +} reporter con differenti colori, cinetica e^{2 +} sensibilità Ca hanno ampliato la scelta di strumenti disponibili di imaging, ma ogni nuovo reporter devono essere convalidati utilizzando il Ca^{2 +}-variante fluorescente insensibile^{14 ,16}.

Media:

Piastre NGM per imaging devono essere preparati con agar di alta qualità. Agar di qualità inferiore non si dissolvono completamente all’autoclave, lasciando piccole particelle che disperdono luce durante imaging e aumentando la fluorescenza di fondo. Agarosio per biologia molecolare può essere utilizzato invece, ma l’importo aggiunto dovrebbe essere ridotta per mantenere la fermezza piastra equivalente.

Confronti con altri metodi di montaggio:

Precedenti approcci all’attività di immagine nel circuito del comportamento di deposizione delle uova sono utilizzati vermi immobilizzati con colla ad un pad di agarosio. Sotto queste condizioni, il circuito attività ed il comportamento di deposizione delle uova non è favorite senza una riduzione in terreni di coltura osmolarità^8,10,44,45. La prova recente suggerisce che numerosi comportamenti di vite senza fine sono modulati dallo stato di locomozione, sollevando dubbi circa il rapporto di attività delle cellule osservati negli animali immobilizzati a quello visto nel comportarsi liberamente gli animali. Abbiamo recentemente dimostrato che attività di deposizione delle uova circuito è gradualmente in modo imprevisto con locomozione^26,27. Allo stesso modo, compartimenti Ca^{2 +} segnalazione nell’Interneurone RIA integra attività dai neuroni sensoriali e testa motore neuroni durante il foraggiamento movimenti⁴⁶. Comportamento di defecazione è accompagnato anche da un cambiamento preciso e stereotipato di locomozione che permette gli animali ad allontanarsi dal loro posto di foraggiamento prima di espellere rifiuti⁴⁷. Insieme, questi risultati suggeriscono che brevi registrazioni di attività di circuito da immobilizzato animali possono essere fondamentalmente diverse da quelli ottenuti a comportarsi liberamente gli animali.

Nonostante sia direttamente sotto un vetrino coprioggetti, comportamento del verme ricorda molto quello visto su piastre standard NGM. Le uova deposte andrà avanti a covare, e la piccola quantità di cibo depositato permette le larve L1 a crescere in adulti (dati non mostrati). La dimensione del blocco grande agar consente lo scambio di gas ragionevole e resiste alla disidratazione, anche se troppo cibo aumenterà la fluorescenza di fondo. Mentre questo metodo funziona meglio per gli adulti, la tecnica utilizzabile anche per animali di immagine di L4. Tuttavia, lo spessore dello strato acquoso tra il pezzo e il coprioggetto è tale che più piccole larve hanno difficoltà strisciando e spesso possono rimanere intrappolate sulla scia di un adulto commovente.

Una limitazione di questa tecnica di montaggio è che la stimolazione meccanica o chimica diretta a precise regioni del corpo è difficile. Recenti sviluppi nelle tecniche di illuminazione con motivi consentono l’eccitazione separata di testa o di coda-espresso microbiche opsine con illuminazione separata e rilevamento della fluorescenza di GCaMP/mCherry nel midbody^48,49. Di conseguenza, è possibile superare questo problema utilizzando approcci optogenetica.

Confronti con altri Ca ^{2 +} Approcci di imaging:

Questo metodo funziona molto bene per la registrazione delle modifiche in citoplasmico Ca^{2 +} da singolo, risolte le cellule e le loro regioni sinaptiche. Formazione immagine in tempo reale, volumetrica dei neuroni nella testa recentemente è stata realizzata utilizzando la posizione dei nuclei delle cellule per l’identificazione delle cellule e per quantificare i cambiamenti nel calcio adrenocorticale^50,51,52. Il rapporto tra nucleare e sinaptica Ca^{2 +} rimane poco chiaro. I nostri dati suggeriscono che il più cospicuo HSN intracellulare di Ca^{2 +} modifiche alla termini presinaptici lontano il soma della cellula (Figura 4). Termini presinaptiche del HSN e i neuroni di VC sono incorporati nei muscoli vulval postsinaptica²⁶. Non è chiaro se ci sarebbe sufficiente risoluzione nella dimensione Z anche con filatura disco o tecniche di foglio leggero di attribuire presinaptici Ca^{2 +} segnali a celle specifiche senza dipendere in qualche modo somatica del calcio per l’identificazione delle cellule . Utilizzando le tecniche descritte qui, ogni 10 min, due canali di registrazione con 12.001 immagini TIFF di 256×256 pixel a 16 bit è ~ 4 GB. Il rapporto modulato e intensità canali doppia rispetto alla dimensione file di ~ 8 GB. Un tipico esperimento registrazione 10 animali da ciascuno dei due genotipi (wild-type e sperimentali) genera quasi 150 GB di dati primari e richiede 20 h per raccogliere e analizzare. Analisi volumetrica con 10 fette Z al timepoint richiederebbe un ordine di grandezza più dati e tempo analitico, spiegando perché così pochi tali studi sono stati completati.

Hardware:

Registriamo e analizzare sequenze di immagini su workstation biprocessore con alte prestazioni schede grafiche (ad es., gaming), 64 GB di RAM, e ad alte prestazioni Solid state drives (Vedi Tabella materiali). Dati devono essere memorizzati in rete matrice ridondante di dischi indipendenti (RAID) e il backup nel cloud presso un centro di dati off-site.

Si consiglia di utilizzare ad alta potenza collimato LED per l’eccitazione di fluorescenza pulsata sopra ad alogenuri metallici o fonti di luce a base di mercurio. Sono disponibili diversi sistemi di LED multi-colore commercialmente disponibili. Mentre alcuni di questi sistemi a LED hanno un costo iniziale più elevato, hanno una lunga durata (> 20.000 h), può contemporaneamente eccitare fluorofori diversi quattro o più e offrono un controllo temporale preciso utilizzando un seriale e/o interfaccia TTL con bassa latenza (10-300 µs passare tempo). Innescando assicura che il campione è illuminato solo quando in realtà sono stati raccolti. Generalmente utilizziamo un’esposizione di 10 ms ogni 50 ms (20% aliquota di dazio). Questo riduce la fototossicità e sfocatura in movimento durante la cattura delle immagini, come precedentemente segnalato⁴³.

Usiamo sCMOS telecamere per la loro velocità e una grande matrice di pixel piccolo, sensibile. Una EM-CCD telecamera è un’alternativa più costosa, ma ‘fioritura’ effetti possono causare catturati fotoelettroni fuoriuscita in pixel adiacenti. Nuovo retro-illuminato sCMOS fotocamere hanno fotosensibilità simili di EM-CCD a costi significativamente ridotti. Indipendentemente da ciò quale sensore è utilizzato, i canali GCaMP5 e mCherry devono essere ottenuti simultaneamente. Acquisizione sequenziale in vermi in movimento porterà a mal registrati immagini inadatti per la quantificazione raziometrici. Formazione immagine doppio canale può essere realizzata su una singola macchina fotografica dopo la scissione di canali utilizzando un’immagine splitter (Figura 2) o due fotocamere identiche. La gamma dinamica di immagini a 16 bit è suggerita sopra immagini di 8 bit per la quantificazione accurata raziometrici. Per le immagini di campo chiaro del comportamento di verme, catturiamo usando una macchina fotografica di 1pollice 4.1 MP vicino infrarosso USB3 per catturare grandi sequenze di immagine a 8 bit 1.024 x 1.024 binned 2×2 dopo compressione JPEG. Il FOV più grande disponibile sui modelli più recenti di microscopio permette un verme adulto possano essere visualizzati a 20x dopo 0.63 x demagnification con solo lieve vignettatura (Figura 4E).

Si consiglia di utilizzare i segnali di tensione standard TTL per sincronizzare l’illuminazione e la cattura di fotogrammi. A causa di latenze potenziali in programmi software diversi, si consiglia di utenti configurare la fotocamera di fluorescenza con uscite trigger come master con uscite TTL guida tutti gli altri dispositivi. In questo modo, informazioni sulla posizione di campo chiaro e fase verranno raccolti per ogni misura di Ca^{2 +} .

Fessura – o risonante microscopi confocali punto-scansione trovati tipicamente in Servizi confocale in comune anche dare prestazioni eccellenti durante raziometrici Ca^{2 +} imaging. Tali strumenti possono essere utilizzati per catturare due o più canali di fluorescenza insieme a campo chiaro²⁴. In questo caso, il foro stenopeico confocale deve essere aperto e il suo diametro massimo, e un rilevatore spettrale dovrebbe essere usato per separare segnali infrarossi campo chiaro, mCherry e GCaMP5. Questo massimizza la luce raccolta da una spessa (~ 20 µm) fetta consentendo comunque il rifiuto di fluorescenza di out-of-focus. L’unico lato negativo è il FOV più piccolo e più restrizioni per personalizzazione hardware e software.

Software:

Maggior parte dei produttori della nave e installare le loro macchine fotografiche e microscopi con software proprietario, inclusa la configurazione di innescare ingressi e uscite. Possono variare le caratteristiche e le prestazioni di questo software durante la registrazione. Perché vermi in rapido movimento può essere difficile tenere traccia, formato immagine durante la registrazione deve essere liscia e stabile a 20 Hz. Per migliorare le prestazioni, sequenze di immagini possono essere temporaneamente salvati in RAM con sottoinsiemi comportamentale pertinenti salvati al termine dell’esperimento. Questi due canali immagine sequenza file possono essere convertiti nel formato immagine Cytometry Standard aperto (ICS) per l’importazione nel software raziometrici quantificazione. OME-TIFF è un formato open source immagine più recente, anche se diverse installazioni possono essere Impossibile salvare sequenze di immagini TIFF superiori a 4 GB.

Una caratteristica fondamentale della pipeline quantificazione è la generazione della scanalatura del rapporto e quindi una procedura di segmentazione non distorta immagine utilizzando mCherry fluorescenza per trovare celle di interesse. Da ogni oggetto trovato, significa che la dimensione dell’oggetto, posizione baricentro XY e il minimo, e vengono calcolati i valori di intensità di fluorescenza massima per ogni canale (compreso il canale di rapporto). Insieme, questi valori vengono utilizzati per quantificare i cambiamenti in intracellulare Ca^{2 +} a ogni timepoint nella registrazione. Misure oggetto per ogni timepoint poi vengono esportate come file CSV per analisi successive.

Una limitazione importante del protocollo descritto qui è la dipendenza lo spostamento dei dati in forme diverse attraverso un patchwork di prodotti software. Un’ulteriore irritazione è che alcuni dei software è open source e gratuito, mentre gli altri sono chiusi, costosi e aggiornato in modo non uniforme. Un importante miglioramento sarebbe usare o sviluppare un pezzo di software (idealmente open source) che fornisce livelli di prestazioni e facilità d’uso dall’acquisizione all’analisi simili. Come notato sopra, analisi raziometrici raddoppia la dimensione del file e il tempo necessario per completare un esperimento. Generazione di driver di fotocamera che può essere integrato in quadri personalizzabili dall’utente come Bonsai avrebbe permesso immagini e altri flussi di dati devono essere raccolti e analizzati in tempo reale, in modo significativo miglioramento velocità effettiva.

Prospettive future:

Mentre si traccia in genere verme movimenti manualmente, rilevamento del centroide verme rilevato nelle registrazioni a infrarossi o scuro-campo chiaro dovrebbe consentire per ulteriori nodi che forniscono circuito chiuso regolazione della posizione di fase e automatizzato di elaborazione di immagini rilevamento (Figura 3 e dati non mostrati). La maggior parte delle registrazioni fluorescenza ottenuto con questo metodo è scuro e privo di dati biologicamente interessanti. Elaborazione delle tecniche che delle colture di sequenze di immagini per gli oggetti rilevanti sul sensore o in tempo reale immagini di post-acquisizione avrebbe permesso per una maggiore risoluzione spaziale e di accelerare la pipeline di analisi di dati, in particolare se ulteriori Z-fette sono raccolti per ogni timepoint visualizzare attività all’interno di tutte le celle di pre- e postsinaptiche nel circuito.