線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

1 系統、文化メディア、および動物の取り付け 標準 60 mm 線虫成長媒体 (NGM) 寒天 OP50エシェリヒア属大腸菌細菌食品19シードの 20 ° C で線虫みみずを育てます。 興味の各セル固有のプロモーターの 2 種のプラスミドを準備: 1 つ、運転レコード細胞内 Ca2 +GCaMP5、第二に、運転を可能にする GCaMP5 の蛍光変化のレシオ メトリック定量 mCherry の式の式とオブジェクトの発見と測定を簡素化します。注: GCaMP5:mCherry レシオ イメージング GCaMP5 蛍光フォーカスと動物の動きの変化、細胞内 Ca2 +の実際の変化に起因する変動を補正します。 LX1832 lite-1(ce314)、lin-15(n765ts) X の変異動物の生殖腺に pL15EK 表示救助マーカー プラスミッドに沿って GCaMP5 と mCherry 発現プラスミドを挿入し、GCaMP5 を表現する非マブラヴlin-15(+)動物を回復し、高コピー遺伝子20,21,22mCherry。青色光回避行動23,24を抑えるlite 1突然変異体バック グラウンドを使用します。 モザイクを削減し、簡素化化合物の突然変異系統25世代の染色体遺伝子を統合します。注: ここで説明した LX2004 ひずみを運ぶ GCaMP5、 nlp 3プロモーターから HSNs で mCherry を表す統合高コピー遺伝子 (参照材料表)26,27,28,29. (e.g.,tph 1, HSN の開発や他のプロモーターと比較して産卵行動に重大な欠陥を引き起こすテストなしに後半 L4 と大人動物のドライブの強い、HSNs 式nlp 3プロモーターが見つかりましたegl 6、およびunc-86)。線虫の遺伝学センターから、このひずみと GCaMP5 と腹側コード (VC) 運動ニューロン、外陰部の筋肉と uv1 神経内分泌細胞の mCherry を表す他の人あり、その建設の詳細が記載されています。27。 OP50 プラチナ ワームの下にシード NGM 寒天プレートから細菌の食品を選ぶを適用し、それを使用して転送 〜 20 の後半 L4 LX2004 動物 GCaMP5 とnlp 3プロモーターから HSNs で mCherry を表す。白の三日月形に囲まれた澄んだ暗いスポットとして、発展途上の外陰部が顕微鏡に表示されることを確認します。24-40 h 20 ° C で動物を孵化させなさい。 ピックに OP50 を適用、孵化後、転送 〜、イメージ投射の間にフィードするワームの後ろに食品の少量を残して、シードされていない NGM プレート ワームの 3。一方、あまりにも多くの食品は背景の蛍光性を増加し、低酸素症を引き起こすプレートの中心から散策するワームを奨励する細菌に食べ物が少ない十分な食糧を確保します。 カットする平らな角の丸いヘラを使用して、~ 20 mm × 20 mm のワームを運ぶプレートからチャンクし、きれいな 24 mm × 60 mm #1.5 coverslip (図 1) の中央に下向きのチャンクを転送します。Coverslip の下敷きとイメージングによる干渉から泡を保つために 1 つの側面からアプリケーションを起動します。こだわりと蒸発を減らすためのチャンクの先頭に 22 mm × 22 mm #1 coverslip を適用します。 2. ハードウェアと計測のセットアップ 段階的な配置、≥ 0.7 と倒立顕微鏡のステージにトランスジェニック ワーム同時 GCaMP5 のフィルターを数値絞りプラン ・ アポクロマート 20 客観的、電動 XY ステージの制御、ジョイスティック、イメージ分割、蛍光 x とmCherry 励起と発光、蛍光、赤外線の明視野イメージング、およびトリガー可能な発光ダイオード (LED) 照明システム (図 2A) 用のカメラ。メモ: 80/20 ビームスプリッターの蛍光カメラに画像信号の 80% および 20% 明視野観察カメラに送信されます。正立型顕微鏡も使用できます、しかし NGM チャンクをスライド ガラスと大型 coverslip の間にこの場合配置必要があります。 双眼鏡の接眼レンズを使用すると、イメージングのためのワームを選択します。動物を選択した場合、コンデンサーの上場所に赤外線フィルターをスライドさせます。 トランジスタートランジ スター論理 (TTL) をトリガーします。 各蛍光カメラで 3 つの TTL トリガー出力線から同軸ケーブルを接続します。最初の出力を LED 照明システムの BNC 入力 #3 に接続します。 2 番目の出力を緑で BNC ‘バナナ’ アダプターに接続し、GPIO に 8 pin GPIO コネクタから茶色線入力 #3 (4 ピン) と赤外線カメラの地面 (pin 5) それぞれ。 #8 デジタル入力を実行してジャンパー線で BNC ‘バナナ’ アダプターに 3 番目の出力を接続し、地上デジタル集録デバイス (図 2B)。 デジタル集録デバイス (DAQ) DAQ マイコン ボードを接続 (材料の表を参照してください) の USB ケーブルを介して PC に。標準 Firmata (材料の表を参照) をプロトコルし、57600 ボーで通信する USB ポートを構成すると、ファームウェアをアップデートします。 Led LED コント ローラー ソフトウェアを実行 (材料の表を参照してください)。470 と 590 nm の両方の Led の ‘連続 ‘ゲート’、[トリガ チャンネル 3’ からトリガー モードを切り替えます。 オンにし、各 LED の LED 電源を入力 (例えばセット、470 nm LED 20%、590 nm の LED を 40% に)。 シリアル ステージ通信盆栽 (材料の表を参照) 内のスクリプト ‘XY ステージ-最終的な’30を実行します。灰色の ‘CsvWriter’ ノードをクリックして、記録を保存するフォルダーを選択して X と Y ステージ情報 (図 3)。DAQ を初期化するツールバーの緑色の矢印を押してください。注: スクリプトでは、蛍光カメラ TTL 信号を送信する X と Y のステージ位置の記録が開始されます。このスクリプトは、データの 4 つの列を出力: フレーム番号、X 位置 (μ m)、Y 座標 (μ m) とフレーム (s) の間の間隔。 録音ソフトウェア赤外線カメラで (材料の表を参照してください) ‘ カスタム ビデオ モード,’ の下で選択「モード 1」(2 x 2 のビニング; 1,024 x 1,024 ピクセル) と”ピクセル形式の Raw 8″。下で ‘ トリガー/ストロボ ‘、「3」、「高」、「14」モードに極性にトリガー入力ライン (GPIO) を設定します。TTL トリガー信号が受信されるまで、フレームの取得を停止するには、「有効」に切り替えます。 そのウィンドウを開いたまま、メインのカメラ ビューのツールバーで赤の「レコード」ボタンをクリックします。保存する画像のフォルダーを選択します。’バッファー’ 記録モードを選択し、JPEG 形式で ‘画像’ を保存します。「録音を開始」取得を初期化するをクリックします。 蛍光カメラと画像分割注: GCaMP5 と mCherry の蛍光チャンネルは、レシオ メトリックを定量化するための適切な画像登録を確実に同時に収集する必要があります。画像分割では、1 つのセンサーに GCaMP5 と mCherry の蛍光の 2 チャンネルを買収をことができます。 画像集録ソフトウェアの「キャプチャ」タブで (材料表を参照)、セットの露出時間を 10 ms、4 x、および画像の深度を 16 ビットにビニング。幅 256 ピクセル、高さ 512 ピクセルの中心カメラ部分配列を選択します。出力トリガー オプションを表示」をクリックし、’正’ すべてのトリガーを設定します。注: 以下の場合は 10 ms、DAQ は TTL トリガーを見逃す時折ことができます。 ‘シーケンス’ タブの下には、25 さんの ‘期間’ と ‘トリガー 1′ と’ トリガー 2′ を ‘露出’ に設定 ‘トリガー 3’ は ‘プログラマブル’ に設定されていることを確保するため、20 Hz 選択 ‘保存一時バッファーにします’ で画像を収集する 50 ms の ‘ フィールド Delay1’ と”時間の経過”を選択 PMT ゲインし、3 チャンネル共焦点イメージング中にレーザー強度 背景の蛍光性は最小 (黒レベル) のすぐ上のレベルでは、光電子増倍管の利得を設定します。シナプス前末端 mCherry チャネルで単一飽和の 12 ビットまたは 16 ビットのピクセルが観察されるまで 561 nm (緑) レーザー パワーが増加します。 GCaMP5 蛍光がシナプス前末端背景の上にだけ表示されるようは、488 nm (青色) レーザーの強度を調整します。蛍光性が強い Ca2 +過渡応答の増加、この低設定は GCaMP5 ピクセルの彩度を防ぎます。共焦点ピンホール光獲得を最大化するすべての方法を開きます。 3. レシオ メトリック Ca2 +イメージングと行動記録 蛍光集録ソフトウェア ‘順序’] タブで、[録音を開始する「スタート」をクリックします。フォーカスのセルと関心のシナプスを視野 (FOV) の中央に維持、ジョイスティックでワームを追跡します。各チャンネルのピクセルの統計を表示するヒストグラム ウィンドウで「分析」ボタンをクリックしてします。 ≥ のシナプス前末端の最大の単一ピクセル mCherry 蛍光 8,000 カウントできるように LED 電源の調整 (~ 4,000 光電子)、与える、〜 背景の上の 12 ビットのダイナミック レンジ (~ 100 光電子)。安静時 (低) Ca2 +の周りする必要がありますの間にシナプス前末端 GCaMP5 信号 〜 2,500 カウント – 背景の上だけに表示されます。 レコード 1 つ産卵のアクティブな状態に達するまで通常これは野生型ワーム7で 20-30 分ごとに発生します。6,000 フレーム最初産卵イベント (フレーム 6,001) 前後に 10 分サブセット (12,001 フレーム) を保存します。行動と XY ステージ位置の縦長同じワームの明視野イメージのサブセットを保つようにしてくださいまたはデータ ・ ストリームを正確に同期が失われます。 ImageJ と BioFormats プラグインを使用して (材料の表を参照) レシオ メトリック定量ソフトウェアにインポートすることができますように、イメージ フローサイトメトリー標準 (.ics) の形式に画像を変換します。 4. 画像のセグメンテーションと定量解析 レシオ メトリック定量ソフトウェアに画像をインポート (材料の表を参照してください)。「ツール」メニューに「自動コントラスト」をクリックし、、適切な黒を確立する各チャンネルのコントラストを調整 (~ 1,800) と白のレベル (10,000)。MCherry および GCaMP5 チャネルの色の割り当てが正しい (図 4A ~ C) であることを確認するには、[ツール] メニューで色を変更」を選択します。 時系列 ‘シーケンス’ タブの上で右クリック、20 フレーム/秒と 1.25 μ m/ピクセルに設定します。 「ツール」メニューから ‘比’ し ‘ チャネル B’ の 『 A チャンネル 』 の”mCherry””GCaMP5″を選択します。各画像のシーケンスから背景を減算する「しきい値」横にある「再計算」をクリックします。「比チャネルに虹 LUT を適用」を選択します。注: 0.3 (低 Ca2 +) の平均基準比と最大比 2-3 (高 Ca2 +) の録画、適切な参照テーブルなる 0 (青) から 1 (赤)。 MCherry チャネル (図 4D) を使用して強度変調比チャネルを生成します。強度変調比チャネルは、mCherry チャネルの輝度比色がマップされる、数百万色の画像です。 [測定] タブで、[プロトコル] ペインに ‘オブジェクトを使用して強度を見つける’ ツールをドラッグしてオブジェクト発見プロトコルを作成します。MCherry のウィンドウの強度値を設定し、オブジェクトを検索する ‘歯’ をクリックします。 強度値 ≥ 2 を選択上記のバック グラウンドの標準偏差 (SD) (の例えば下限 ~ 65,535 の 2,500、上限)。シナプス前末端が検出され、測定メニューからを選択する自動的に「アップデート」フィードバックを確認してください。注: 関連プロトコル ‘SD 強度’ を使用して背景から彼らの標準偏差によって、ソフトウェアはオブジェクトを識別できるもただし、特に明るいオブジェクト視野に入る、それ、ハイブリッドスパイクニューロンを見つけるために使用強度ヒューズに影響を与えるそれらの縦長の中には平均強度大幅を変更できます。生の強度値を使用してオブジェクトを検索する場合、この変動は発生しません。 頭のような不要なオブジェクトを除外する必要がある場合、mCherry のチャネル(サイズ、最大強度等)のみを対象とする追加のフィルター、尾し、腸の蛍光を追加します。測定メニューから ‘ する計測項目」を選択して、’ すべて縦長 ‘注: これは、プロトコルは、すべての測定値を [ファイル] メニューの [エクスポート] コマンドを使用してエクスポートする必要がありますコンマ区切り値 (.csv) ファイルに書き込むが実行されます。 Exported.csv ファイルを開くし、重心 Y (μ m) データ、重心 X (μ m)、意味 (比チャンネル) エリア (μ2) Timepoint を新しいシートにコピーします。列見出しのない a.csv ファイルをエクスポートします。レシオ メトリック定量ソフトウェアは、timepoint あたりの 1 つまたは複数のオブジェクトとして興味の細胞を分類するかもしれません。 これらのオブジェクトを再結合、カスタム スクリプトの ‘AnalzyeGCaMP_2017.m’ を使用します。注: スクリプトも Ca2 + (比) データのピークを識別、縦長、ピーク振幅、およびピーク幅の a.csv ファイルを保存します。それはまた生と注釈付き比トレース postscript ファイルを生成します。この情報により、Ca2 +非定常振幅と間の一時的な間隔を決定する必要があります。 盆栽から XY ステージ スクリプトによって記録された X と Y の値に各蛍光オブジェクトから出力 X と Y の重心値を追加します。Net の XY 位置を使用してワーム歩行トレースを生成し、細胞の変位を計算して、異なる動作を伴う速度状態31。 ImageJ に仮想スタックとして記録し、明視野画像をインポートします。産卵イベントやその他の動作に注釈を付けます。Ca2 +ピーク比トレースからこれらのイベントのタイミングを比較します。