JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56911
, , , , ,
1Neuroscience Program,University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology,University of Miami

Summary

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Abstract

Hayvanlar davranmak nöral devre etkinliğini önemli ölçüde imzalat veya immobilize hayvanlarda görülen dan farklıdır giderek netlik kazanmıştır. Son derece hassas, genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Ca2 + hücre ve non-invaziv optik yaklaşımları kullanarak davranıyor hayvanlarda sinirsel aktivite kayıt devrim. Genetik ile birleştirildiğinde ve optogenetic teknikleri, moleküler mekanizmaları bu modüle hücre ve devre aktivite sırasında farklı davranış Birleşik belirlenebilir.

Burada özgürce Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde tek nöronların ratiometric Ca2 + görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz hayvanlar, kaydedilecek izin bindirmeleri solucanlar üzerinde standart bir yuvarlak solucanlar büyüme medya (NGM) agar büyüyen bir cam coverslip ile hafifçe engellemek basit montaj tekniği göstermek sınırsız hareket ve davranış sırasında yüksek çözünürlüklü. Bu teknik ile onlar sürücü davranış yumurta döşeme gibi intrasellüler Ca2 + serotonerjik hermafrodit belirli nöronlar (HSNs) içinde değişiklikleri kaydetmek için hassas Ca2 + muhabir GCaMP5 kullanın. MCherry, bir Ca2 +co ifade tarafından-büyük küçük harf duyarlı floresan protein, HSN içinde konumunu takip ~ 1 µm ve odak veya hareket değişiklikleri nedeniyle Floresans dalgalanmalar için doğru. Aynı anda, kızılötesi aydınlık alan görüntüleme davranış kayıt ve hayvan izleme motorlu sahne kullanarak sağlar. Etkin ve etkin davranış durumlar arasında üzerinde dakika onlarca yaparak bu mikroskobik teknikler ve veri akışları entegre ederek, biz Ca2 + etkinliğini yumurta atarken C. elegans devrede kaydedebilirsiniz.

Introduction

Nörolojik bilimler merkezi amacı nasıl devrelerde sürücü hayvan davranışları için nöronlar iletişim anlamaktır. Sinir devreleri devre etkinlik, böylece davranış değişiklikleri hayvanlar için ortamlar için yanıt için gerekli sürüş değiştirmek için farklı duyusal ipuçlarını bir dizi entegre. Yuvarlak solucanlar, C. elegans, kimin sinaptik bağlantıların tamamen eşlenen1olduğu 302 nöronlar ile basit bir sinir sistemi vardır. Ayrıca, proteinler neurotransmission içinde yer alan için kodlamak genler C. elegans ve memeliler2arasında son derece korunmuş. Onun sinir sisteminin anatomik basitliğine rağmen korunmuş davranışları nasıl davranış3nöronlar düzenleyen anlamak için verimli bir platform sağlayan karmaşık bir repertuar görüntüler.

C. elegans genetik manipülasyon, lazer hücre ablasyon, Elektrofizyolojik teknikleri gibi vivo içinde 4,5Imaging optik gibi yaklaşımlar geniş bir uygulama için mükellef. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kolinerjik dahil C. elegans ve GABAergic nöronal ağlar sistemlerinin sinyal büyük nörotransmitter ayrıntılı haritalar doğurmuştur. Bu çalışmalar, tüm nöronal G-protein birleştiğinde reseptörlerinin ifade eşlemek için devam eden çalışmalar ile birlikte bu model son derece detaylı yapısal kaldıraç için benzersiz bir konumda yerleştirin ve fonksiyonel nöronal bağlantı haritalar tam olarak anlamak için nasıl bu farklı reseptörleri ve sürücü farklı yönleri hayvan davranışları ile zaman çizelgelerine aracılığıyla farklı nörotransmitter sinyal.

Herhangi bir sistemdeki dinamik nöronal aktivite desen çalışması için önemli bir önkoşul etkinliklerini bireysel nöronlar veya tüm devreler davranışları sırasında kaydetmek için güçlü yöntemler geliştirmektir. Amenability optik bu tür yaklaşımların sinaptik vezikül füzyon sürücüler presynaptic aktivite görselleştirmek için özellikle önemlidir. Hızlı ve son derece hassas floresan gazetecilere intrasellüler Ca2 +, duyarlı photodetectors, artan kullanılabilirliği ile birlikte hücre ve uyanık, yaşayan hayvanlarda sinirsel aktivite kayıt davranış sırasında devrim. Ca2 + kanalları düzenleyen sinaptik elektriksel aktivitenin önemli bir sonucu olduğu için değişimler intrasellüler Ca2 + hücre etkinliğinde sadakatle rapor davranışsal ilgili değişiklikleri tahmin edilmektedir.

Bu çalışmada, C. elegans6,7yumurta döşeme davranışı teşvik serotonerjik HSN motor nöronlar ratiometric Ca2 + görüntüleme gerçekleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım Ca2 + C. elegans etkinliğinde ve yumurta atarken devre davranış5,8,9,10sırasında,11 görselleştirmek için önceki çabaları oluşturur . Yöntemi aynı anda hayvan Lokomotor devlet değişikliklerin yanı sıra yumurta atarken olayları ile hücre/devre faaliyette gözlenen değişiklikleri ilişkilendirmek için sağlar. Biz bu yaklaşım yetişkin solucanlar etkinliğinde çalışmaya kullansa da, bizim laboratuvar yayınlanmamış işten bu yaklaşım için Juvenil hayvanlar dördüncü larva (L4) aşamasında de uzatılabilir gösterir. Bu işlev farklı devreler ve davranışları diğer C. elegans nöronların aktivitesinin bu tekniği ile benzer şekilde erişilebilir olmalıdır muhtemeldir. Diğer son zamanlarda geliştirilen hızlı Ca ile üst üste emisyon spectra12,13,14,15,16,2 + göstergeleri optogenetic araçlar17 ve genetik olarak membran voltajı18optik göstergeleri kodlanmış, bize nasıl sinir devresi aktivite değişiklikleri farklı davranış Birleşik sürücü içine delici ‘all-optik’ araştırmalar gerçekleştirmek izin vermelidir.

Protocol

1. suşları, kültür medya ve hayvanlar montajı 20 ° C’de C. elegans solucanlar standart 60 mm Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) agar plakaları ile OP50 E. coli bakteriyel gıda19numaralı seribaşı büyümek. İki plazmid faiz her hücre özgü organizatörü için hazırlamak: bir, için kayıt intrasellüler Ca2 +GCaMP5 ve mCherry GCaMP5 floresan değişiklikler ratiometric Nefelometri için izin vermek için ifade sürüş ikinci ifadesi sürüş ve nesne bulma ve ölçüm basitleştirin.Not: GCaMP5:mCherry ratiometric görüntüleme odak ve hayvan hareketi değişimler, intrasellüler Ca2 +değil gerçek değişiklikler sonucu GCaMP5 floresan dalgalanmalar düzeltir. GCaMP5 ve mCherry ifade plazmid pL15EK görünür kurtarma işaret plazmid ile birlikte LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X mutant hayvanlar gonads enjekte ve sigara Muv lin-15(+) hayvanlar GCaMP5 ifade yeniden elde etmek ve mCherry yüksek-kopya transgene20,21,22. 1 litre mutant arka plan mavi ışık kaçınma davranışı23,24azaltmak için kullanın. Transgenes kromozomlar mozaizm azaltmak ve bileşik mutant suşları25nesil kolaylaştırmak için entegre.Not: Burada açıklanan LX2004 gerilme GCaMP5 ve mCherry HSNs nlp-3 organizatörü üzerinden ifade entegre bir yüksek-kopya transgene taşır (bakınız Tablo reçetesi)26,27, 28 , 29. (e.g.,tph-1, HSN geliştirme veya yumurta döşeme davranışı diğer Organizatör için karşılaştırıldığında önemli hataları neden test olmadan nlp-3 organizatörü sürücü güçlü ifade geç L4 ve Yetişkin Hayvanlar için HSNs bulundu egl-6ve unc-86). Bu zorlanma ve diğerleri GCaMP5 ve mCherry ventral kordon (VC) motor nöronlar, vulva kas ve uv1 nöroendokrin hücrelerin ifade Caenorhabditis genetik Merkezi’nden alınabilir ve yapım ayrıntıları açıklanan 27. Bakteriyel bir numaralı seribaşı NGM agar tabak Platin solucan altına gıda almak OP50 uygulamak ve aktarmak için kullanmak ~ GCaMP5 ve mCherry HSNs nlp-3 organizatörü üzerinden ifade 20 geç L4 LX2004 hayvanlar. Gelişmekte olan vulva beyaz Hilal tarafından çevrili bir açık karanlık nokta olarak bir stereomicroscope göründüğünden emin olun. Hayvanlar için 24-40 h 20 ° C’de kuluçkaya. Kuluçka sonra OP50 uygulamak için çekme ve transfer ~ 3 solucanların gıda üzerine görüntüleme sırasında beslemek solucanlar için az miktarda bırakarak bir seribaşı NGM plaka. Çok az bakteriyel gıda süre çok fazla yemek arka plan Floresans artırmak ve hipoksi neden plaka merkezinden dolaşmaya solucanlar teşvik edecek yeterli gıda, garanti. Kesmek için bir düz yuvarlak spatula kullanın bir ~ 20 x 20 mm yığın solucanları taşıyan plaka ve yığın aşağı doğru bir temiz 24 mm x 60 mm #1.5 coverslip (şekil 1) Merkezi aktarın. Bir taraftan kabarcıklar coverslip altında kapana kısılmış ve görüntüleme ile engel olmaktan tutmak için uygulamayı başlatın. 22 x 22 mm #1 coverslip yapıştırma ve buharlaşma azaltmak için yığın üstüne uygulayın. 2. donanım ve Araçları Kurulum Aşamalı yerleştirin, Sahne Alanı’na bir ≥ 0,7 ile ters bir mikroskop transgenik solucanlar sayısal diyafram planı-Apochromat 20 x objektif, motorlu XY sahne bir joystick, bir resim splitter ve floresan ile kontrol edilebilir filtreler için aynı anda GCaMP5 ve mCherry uyarma ve emisyon, floresan ve kızılötesi aydınlık alan görüntüleme ve triggerable bir ışık yayan diyot (LED) aydınlatma sistemi (Şekil 2A) fotoğraf makineleri.Not: Bir 80/20 kiriş-splitter Floresans kameranın görüntü sinyalinin % 80 ve % 20 aydınlık alan kamera gönderir. Dik bir mikroskop-ebilmek da var kullanılmış, ama NGM yığın bir cam slayt ve büyük coverslip arasında bu durumda yer almalıdır. Dürbün göz mercekleri bir solucan görüntüleme için seçmek için kullanın. Bir hayvan seçildiğinde, kondansatör yukarıda yer kızılötesi filtreye kaydırın. Transistör transistör mantık (TTL) Tetikleyicileri Her üç TTL tetikleyici çıktı satırlarının Floresans kameranın koaksiyel kabloları takın. İlk çıkış LED aydınlatma sistemi BNC girişine #3 bağlayın. Yeşil bir BNC ‘muz’ bağdaştırıcısıyla ikinci çıkış bağlanmak ve kahverengi teller GPIO için çalışan 8-pin GPIO konektöründen #3 (4 pin) ve zemin (PIN 5) kızılötesi fotoğraf makinesinin, sırasıyla giriş. Üçüncü çıkış #8 dijital giriş çalışan jumper kabloları ile bir BNC ‘muz’ bağdaştırıcısına bağlayın ve dijital satın alma aygıt (Şekil 2B) zemin. Dijital satın alma aygıt (DAQ) DAQ Mikrodenetleyici kurulu bağlanmak ( Tablo malzemelerigörmek) PC yolu ile USB tel kablo. Standart Firmata ( Tablo malzemelerigörmek) protokol ve 57600 baud iletişim kurmak için USB bağlantı noktası yapılandırma ile firmware güncelleştirmek. LED’ler LED denetleyicisi yazılımı çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek). ‘Sürekli ‘Gated’ ve select tetikleyici kanal ‘ 3’ tetikleyici modundan 470 ve 590 nm LED’ler için geçer. Açmak ve her LED LED güç girin (Örneğin, küme 470 nm LED için % 20 ve 590 nm LED % 40’a). Seri-sahne iletişim Bonsai ( Tablo malzemelerigörmek) komut dosyası ‘XY sahne final’30çalıştırın. Üzerinde gri ‘CsvWriter’ düğümü tıklatın ve kaydedilmiş kaydetmek için bir klasör seçin X ve Y sahne bilgi (şekil 3). Yeşil ok ucu DAQ başlatmak için araç çubuğu tuşuna basın.Not: Komut dosyası Floresans kameranın TTL sinyal gönderir X ve Y sahne pozisyon kayıt başlayacaktır. Bu komut dosyası dört sütun veri çıkışları: çerçeve numarası, pozisyon (µm), Y konumu (µm) ve çerçeveler (s) arasındaki aralığı X. Kızılötesi kamera kayıt yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek) ‘Özel Video modları’ altında seçme “Tarz 1” (2 x 2 binning; 1024 x 1024 piksel), ve “piksel biçimini Raw 8”. Altında ‘ tetikleyici / Strobe’, “3”, “Yüksek”, ’14″‘moduna’ polarite için tetikleyici giriş hattı (GPIO) ayarlayın. ‘Bir TTL tetikleyici sinyal alınana kadar çerçeve kazanım durdurmak için Enable’ geçiş. O pencereyi açık bırakarak, ana kamera görünüm araç çubuğundaki kırmızı “Kayıt” düğmesini tıklatın. Kaydedilecek görüntü dizileri için klasörü seçin. ‘Buffered’ kayıt modunu seçin ve ‘Görüntüleri’ JPEG formatında kaydedin. “Başlamak satın başlatmak için kayıt”‘ı tıklatın. Floresans kamera ve görüntü splitterNot: GCaMP5 ve mCherry floresan kanalları aynı anda uygun görüntü kayıt ratiometric Nefelometri için emin olmak için toplanan gerekir. Bir resim splitter iki kanallı bir sensör üzerine GCaMP5 ve mCherry floresan edinimi olanak sağlar. Görüntü alma yazılımı ‘Yakalama’ sekmesinde (bakınız Tablo malzemeler), set çekim hızı 10 MS, 4 x ve 16-bit görüntü derinliği için binning. 512 piksel genişliğinde 256 piksel yüksek ortalanmış kamera subarray seçin. ‘Çıkış tetikleyici seçeneklerini göster’ tıklatın ve küme için ‘Pozitif’ tüm tetikleyicilerNot: DAQ bazen 10 ms olmaları durumunda veya daha az TTL Tetikleyicileri kaçırabilirsiniz. ‘Tetikleyici 3’ ‘Programlanabilir’ ayarlanmışken ‘Tetikleyici 1’ ve ‘Tetikleyici 2’ ‘Maruz kalma’ ‘Sequence’ sekmesi altında 25 Bayan ‘nokta’ ayarlayınız, 20 Hz. Select ‘için geçici arabellek kurtarmak.’ adlı görüntüleri toplamak için 50 MS ‘Alan Delay1’ ile ‘Zaman atlamalı’ seçin Devresel_ödeme kazanç ve üç kanal confocal görüntüleme sırasında yoğunluğunu lazer Arka plan floresan en az (siyah seviyesi) hemen üstünde bir düzeyde bu yüzden Devresel_ödeme kazanç ayarlayın. Tek bir doymuş 12 bit veya 16-bit piksel mCherry kanal presynaptic terminus adlı görülmektedir kadar 561 nm (yeşil) lazer gücünü arttırın. Böylece GCaMP5 floresan arka plan yukarıda presynaptic terminus, sadece görülebilir 488 nm (mavi) lazer yoğunluğunu ayarlayın. Floresans yanıt olarak güçlü Ca2 + geçişler arttığında bu düşük ayar GCaMP5 piksellerin doygunluğunu engeller. Sonuna kadar ışık yakalama en üst düzeye çıkarmak için confocal iğne deliği açmak. 3. Ratiometric Ca2 + görüntüleme ve davranış kaydı Floresans edinme yazılım ‘Sequence’ sekmesi altında “kaydetmeye başlamak Başlat”. Solucan hücreleri ve sinapslarda ilgi odağı ve görüş alanı (FOV) ortasına koruyarak joystick ile izlemek. Piksel istatistikler her kanal için çubuk grafik penceresinde ‘İstatistiği’ düğmesini tıklatın. En fazla tek piksellik mCherry floresan ≥ presynaptic terminus, 8.000 sayar sağlamak için LED güç ayarlama (~ 4.000 photoelectrons), veren bir ~ 12-bit dinamik alan arka plan yukarıda (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 sinyalleri2 + -meli var olmak çevresinde dinlenme (düşük) Ca sırasında presynaptic terminus adlı ~ 2500 sayar – arka plan üstüne sadece görünür. Bir yumurta atarken etkin duruma ulaşıncaya kadar kaydı; genellikle bu bir vahşi tipi solucan7her 20-30 dk oluşur. Bir 10dk alt (12,001 çerçeveler), 6000 kare öncesi ve sonrası ilk yumurta atma olayı (çerçeve 6,001) kaydedin. Davranış ve timepoints XY sahne pozisyonun solucan görüntülerin aydınlık alan aynı alt küme küme tuttuğunuzdan emin olun veya veri akışlarını kesin eşitlenmesi kaybolacak. ImageJ ve BioFormats eklenti kullanın (Bu Ratiometric Nefelometri yazılım alınabilir görüntü sıralarını görüntü sitometresi standart (.ics) biçimine dönüştürmek için Malzemeler tablobkz:). 4. görüntü segmentasyonu ve kantitatif analiz Almak görüntü sıralarını Ratiometric Nefelometri yazılımına ( Tablo malzemelerigörmek). ‘Otomatik Kontrast’ ‘Araçlar’ menüsünü tıklayın ve uygun siyah kurmak için her kanalının karşıtlığı ayarlayın (~ 1800) ve beyaz düzeyleri (10.000). ‘Renkleri Değiştir…’ mCherry ve GCaMP5 kanal renk atamalarını doğru (şekil 4A – C) olduğunu doğrulamak için Araçlar menüsünden seçin. Saat serisi ‘Sequence’ sekmesinde sağ tıklayın ve 20 kare/s ve 1,25 µm/piksel için ayarlayın. ‘Oran’ ‘Araçlar’ menüsünden seçin ve “GCaMP5” ‘A kanal’ ve “mCherry” için ‘İçin kanal B’ seçin. “Hesapla” yanındaki ‘eşik’ her görüntü sırası arka plan çıkarmak için tıklatın. “Bir gökkuşağı LUT oranı kanala Uygula” seçeneğini belirleyin.Not: 0,3 (düşük Ca2 +) ortalama temel oranında ve en fazla 2-3 (yüksek Ca2 +) oranında bir kayıt için uygun arama tablosu 1 (kırmızı) 0’dan (mavi) olur. MCherry kanal (şekil 4D) kullanarak bir yoğunluk oranı modülasyonlu kanalı oluşturur. Yoğunluk oranı modülasyonlu kanal bir oranı renk mCherry kanal parlaklık nerede eşlenen renkler milyonlarca görüntüdür. ‘Ölçüm’ sekmesi altında bir nesne bulma Protokolü ‘Bulmak nesneleri kullanarak yoğunluğu’ Aracı ‘Protokol’ bölmesine sürükleyerek oluşturun. MCherry pencere yoğunluk değerleri ayarlamak ve nesneleri bulmak için ‘dişli’ tıklatın. Yoğunluk değerleri ≥ 2 seçin standart sapma (SD) arka plan üzerinde (Örneğin, alt limit ~ 2500, üst sınırı 65. 535 ‘). Presynaptic terminus algılanır ve otomatik olarak ‘geribildirim güncelleme’ ölçümleri menüsünden seçili olduğundan emin olun.Not: Yazılım aynı zamanda nesneleri ilgili Protokolü ‘SD yoğunluğu.’ kullanarak arka plan onların standart sapma tanımlayabilirsiniz Özellikle parlak nesne FOV girerse, Bununla birlikte, önemli ölçüde ortalama yoğunluğu HSN bulmak için kullanılan yoğunluk cutoffs etkileyen bu timepoints sırasında değiştirebilirsiniz. Nesneleri bulmak için ham yoğunluk değerleri kullanılırsa bu değişkenliği oluşmaz. Ek filtreler istenmeyen nesneleri gibi kafa, dışlamak gerekirse sadece mCherry kanal (boyut, Max yoğunluğu vb.)hedefleme kuyruk ve floresan bağırsaklarını ekleyin. ‘Yapmak ölçüm öğesi’ ölçümleri menüden seçin ve seçmek ‘Bütün Timepoints.’Not: Bu tüm ölçümler Dosya menüsündeki ‘ver’ komutunu kullanarak ihraç edilebilir bir virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyasına yazma protokolü, yürütülür. Exported.csv dosyasını açın ve Timepoint, alan (µm2), ortalama (oranı kanal), Centroid X (µm) ve Centroid Y (µm) veri yeni bir sayfayı kopyalamak. A.csv dosyası sütun başlıkları olmadan ver. Ratiometric Nefelometri yazılım bir hücre ilgi timepoint başına bir veya daha fazla nesne olarak sınıflandırmak. Bu nesneler birleştireceğimi için özel bir komut dosyası ‘AnalzyeGCaMP_2017.m’ kullanın.Not: Komut dosyası aynı zamanda Ca2 + (oranı) doruklarına veri tanımlar ve onların timepoints, en yüksek genlikleri ve tepe genişlikleri a.csv dosyasını kaydeder. Ayrıca ham ve ek açıklama eklenen oranı izlemeleri için postscript dosyaları üretir. Bu bilgileri kullanarak, Ca2 + geçici genlik ve arası geçici aralığı tespit edilmelidir. Çıkış X ve Y centroid değerleri her Floresans nesneden XY-sahne komut dosyasından Bonsai tarafından kaydedilen X ve Y değerlerini ekleyin. Net XY pozisyon bir solucan hareket izleme üretmek için ve hücre deplasman ve farklı davranış Birleşik31eşlik hız hesaplamak için kullanın. Kaydedilen aydınlık alan görüntüleri ImageJ sanal bir yığın içe aktarın. Yumurta atarken olaylar ve diğer davranışları açıklama ekleyin. Bu olayların zamanlaması oranı izleme Ca2 + peaks için karşılaştırın.

Representative Results

Burada açıklanan basit montaj tekniği (şekil 1), yüksek çözünürlüklü bir cam coverslip (şekil 4) aracılığıyla hayvanlar davranmak kayıt izin verirken, L4 ve yetişkin C. elegans kültür ortamını en az değişikliklere neden olur. Kadar büyütme (20 x) yüksek sayısal diyafram hedefleri (0,7-0,8) ile 1 h. orta sağlar için senkronizasyon LED ışık kaynakları, sahne alanı denetleyicileri ve fotoğraf makinesi Pozlama veri toplama birden çok dere 20 kare/s den iyi sağlar Uzaysal çözünürlük 4 x 4 piksel (1,25 µm/piksel) binning ile bile yumurta döşeme davranışı devre, sinaptik bölgesinin. GCaMP5 ve mCherry floresan sinyallerini (şekil 4A, B) eşzamanlı edinimi hayvan hareketi ve odak (şekil 4D) değişiklikler dengeler bir piksel piksel oranı kanal oluşturmak için kullanılır. HSN presynaptic terminus C. elegansbirçok nöronal hücre gövdelerinde ve presynaptic HSN Ca2 + değişiklikleri açıkça görüntülenmeyecektir kadar güçlüyse zaten. Kızılötesi aydınlık alan kameranın geniş FOV (şekil 4E) kayıt sırasında el ile izlenmesi gereken solucan sağlar. Her hayvan için intrasellüler Ca2 + değişiklikleri aydınlık alan görüntülemede yumurta yayın ve değişiklikleri hareket (şekil 4E) dahil olmak üzere belli davranışları ile ilişkili olabilir. HSN Ca2 + ve hız Nefelometri yumurta döşeme davranışı için geçiş olarak solucanlar onların hareket değiştirmek onaylar. Öncesinde, sırasında ve sonra yumurta atarken etkin duruma (şekil 5A) solucan hız önemli farklılıklar vardır. Bu gürültü görüntüleme veya izleme sistemi için doğal kaynaklanır değil. Bir yumurta atarken olay yakınlaştırma, biz güçlü bir gözlemlemek GCaMP5 floresan (ΔF/F) mCherry floresan nispeten ise yumurta atma olayı önce değişiklik değiştirmeden (şekil 5B). GCaMP5:mCherry oranı (ΔR/R) ölçülen değişiklikler açıkça göstermek an HSN Ca2 + geçici ~ 4 s önceden yumurta versiyon (şekil 5B). Vulva kas kasılması ile çakışık, solucan hareket açık bir yavaşlama uçları yumurta ile serbest oluşur. Önceki sonuçları HSNs tarafından innervated, kolinerjik VC motor nöronlar güçlü vulva kas kasılmaları ve yumurta sürüm 8,10,27sırasında en yüksek etkinliğini gösteren göstermiştir. Biz de VC nöronların optogenetic harekete geçirmek hareket, hemen bir yavaşlama sürücüler göstermiştir VC nöronlar tarafından vulva kas kasılması devrede olabilir düşündüren, böylece yumurta sürüm27 geribildirim alma kadar hareket yavaşlaması . Görüntüleme ve izleme sistemi açıklanan davranış (şekil 5C) yumurta atarken mekansal organizasyonu görselleştirme sağlar. Daha önce gösterilen, solucanlar girin hemen önce etkin duruma32ileri hareket sürekli çalışır. Solucanlar bakteri agar yığın ortasındaki yiyecek arama zaman çoğunluk harcamak. Etkin durum girmesinden önce solucanlar seyrek HSN Ca2 + geçişler görünümü ile çakışık gıda uzak taşımak. HSN etkinlik sonra yumurta atarken olaylar ayakta birkaç yakından aralıklı HSN Ca2 + geçişler ile patlama ateş içine geçişler. Solucanlar daha sonra kez arkanı, ileriye doğru hareket devam ve yumurtalarını OP50 bakteri yakınındaki başlangıç konumlarına geri doğru yolda. Değişiklikleri yerel O2 ve/veya CO2 konsantrasyonu nerede yumurta33,34bırakmaya solucanlar karar etkileyen olabilir tahmin. Şekil 1. C. elegans yumurta atarken devre faaliyet ve davranış yüksek çözünürlükte görüntüleme için teknik montaj. Üst taraftan son mount. Alt, son mount olarak büyük coverslip alt aracılığıyla izlendi. Oklar, OP50 bakteriyel gıda, C. elegans solucanlar ve yumurta, sandviç NGM agar yığın ve geniş 24 mm x 60 mm coverslip arasında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 . Widefield ratiometric Ca2 + görüntüleme ve bir ters epifluorescence mikroskobunun kayıt davranışı. (A)solucan konumu ve davranış içinde aydınlık bir 20 x (0.8 NA) üzerinden alan yakalanan planı-Apochromat amacı halojen lamba NGM yığın aracılığıyla yaydığı kızılötesi (750-790 nm) ışık (mor oklar) kullanarak. Bir oyun çubuğu ve motorlu sahne alanı denetleyicisi kayıt sırasında belgili tanımlık kurt görüş alanı içinde korumak için kullanılır. Sahne pozisyon (Δx, Δy) PC seri bağlantı noktası tarafından gönderilir. GCaMP5 ve mCherry proteinlerin içinde belgili tanımlık kurt heyecanlı 470 kullanarak nm (mavi oklar) ve 590 nm (sarı ok) ışık yayan diyot (LED). Yayılan GCaMP5 (Yeşil ok) ve mCherry (turuncu oklar) floresan kızılötesi ışık ile birlikte bir çok bantlı dikroik aynadan geçirir ( Tablo malzemelerigörmek). Bir 80/20 kiriş-splitter 0,63 x demagnifer yakalama için aracılığıyla ışık % 20’si bir kızılötesi duyarlı CMOS fotoğraf makinesi (mor ok) gönderir. Kalan % 80’i ışığa GCaMP5 ayıran bir resim splitter mikroskop yan-bağlantı noktasından gönderilir ve mCherry floresan üzerine ayrı bir sCMOS kamera yarısı kızılötesi aydınlık alan ışık kaldırılırken. Her ikisi fotoğraf makinesi verilerden bir PC’ye USB3 kablolar aktarılır. Floresan sCMOS kamera (mavi) tetikleyici bağlantı noktaları göndermek için kullanılır + 5V TTL LED aydınlatma sistemi, kızılötesi aydınlık alan CMOS kamera ve dijital satın alma aygıt (DAQ) tetikler. (B) tetikleyici 3 TTL sinyalleri dijital pin #8 adlı DAQ tarafından algılanan ve PC USB bağlantısı üzerinden gönderilen çıktı. Bu Dijital Giriµ tetikleyen bir ‘ nerede XY’ X ve Y konumu yakalanan her GCaMP5/mCherry floresan/kızılötesi görüntü için sahne okur Bonsai yazılım komut dosyasından (XY sahne final) seri komut. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Bonsai seri-sahne iletişim komut dosyası XY sahne final yerleşimini. Üst DigitalInput düğümü (pembe) TTL Tetikleyicileri DAQ pin #8 gelen okur. Her pozitif TTL gerilim (yeşil) için DAQ bir zaman damgası (mavi) yapar ve seri bağlantı noktası (gri) ile sahne alanı denetleyicisine ‘Nerede XY?’ dizeyi (pembe) yazar. SerialStringRead düğümü (pembe) X ve Y Koordinat yanıt sahne alanı denetleyicisinden okur. Bu dize sonra mikron dönüştürülür ve içine ayrılır X ve Y koordinatları sahne. Son olarak, bu dört akarsu bir ZIP düğüm (mavi) kullanılarak birleştirilir ve dört column.csv dosyası yazılır: TTL sinyalleri (aralığı düğümü, pembe) alınan çerçeve sayısı, X ve Y koordinatları ve sonraki timepoints arasındaki aralığı (genellikle ~ 50 ms zaman kayıt 20 Hz). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : HSN Floresans ve yumurta atarken davranış sırasında bütün hayvan aydınlık alan temsilcisi filmler. (A-D) GCaMP5 ve mCherry floresan HSNs hemen önce yumurta yayın içinde aynı anda ratiometric görüntüleme. HSN presynaptic termini ok uçları ile gösterilir. (C) birleştirme, GCaMP5 ve mCherry floresan. (D) yoğunluk modülasyonlu GCaMP5:mCherry oranı; yüksek bir oranı (kırmızı) yüksek intrasellüler Ca2 + presynaptic terminus adlı gösterir. (E) aydınlık alan görüntü tüm solucanın sonra sadece yumurta bırakırlar. Ok uçları içinden yumurta koyulur vulva anterior ve posteiror yarısını gösteriyor. Ölçek çubuğu tüm resimler için olduğunu 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : HSN Ca2 + ve hareket hızını yumurta atarken davranış sırasında kayıt. (A)GCaMP5:mCherry oranı değişiklikleri yanıt olarak intrasellüler Ca2 + geçişler (ΔR/R; kırmızı) anlık solucan hız (µm/s; mavi) ile birlikte izleri. Olaylar yumurta atarken ok uçları tarafından belirtilir. HSN GCaMP5 floresan (yeşil; ΔF/F), mCherry floresan (kırmızı; ΔF/F), GCaMP5:mCherry floresan oranı (siyah; ΔR/R) ve solucan (B) izleri (mavi) yumurta serbest bırakmak an hız. (C) kayma organizasyonu yumurta döşeme ve hareket davranışları tüm 10dk kayıt sırasında. Solucan parça bağlanmış olan mCherry floresan kaydından alınan HSN centroid konumunu XY sahne bilgilerden elde edildi. HSN geçişler (kırmızı daireler) zamanlaması, olaylar (siyah ok uçları), yumurta döşeme ve başlangıç ve bitiş kayıt (yeşil ve mavi elmas) gösterilir. Ölçek çubuğu olduğunu 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Transgenes:

MCherry ifade kodon-iyileştirme ve intron ekleme geliştirilmiş (en çok kullanılan GCaMP gazetecilere değil çünkü), enjekte ~ 4 x GCaMP5 floresan güçlü Ca sırasında karşılaştırılabilir düzeyde sağlamak için GCaMP5 ifade plazmid miktarı 2 + geçişler. Transjenik hayvanlar yumurta döşeme ve diğer davranışları35en az düzeyde etkisi ile facile kurtarılması için lin-15(n765ts) mutasyon kurtarma sağlar. Transgenes tek tip ifade ve farklı hayvan25arasında koşulları görüntüleme sağlamak için entegre edilebilir. Seçilebilir işaretleri antibiyotik direnci36,de dahil olmak üzere37 ve sıcaklığa duyarlı lethals38 kurtarılması da çalışması gerekir, ama çünkü sigara Transjenik hayvanlar ölü, onay transgene entegrasyon ve homozygosity, görünür fenotip25mevcut işaretlere göre daha zordur. Normal hareket bozabilir ve fitness, rol-6(dm)gibi azaltmak baskın işaretler kaçınılmalıdır39olmalıdır. 1 litre Imaging mutant arka plan görüntüleme23,40,41sırasında mavi ışık kaçış yanıt-e doğru azaltmak için esastır. Paralel lite-1olarak davranan gür-3, ek mutasyon daha fazla kalan davranış ve fizyolojik değişiklikleri mavi ışık42tarafından kaynaklanan en aza indirmek. Elverişli bir konuma sahip, gür-3, 1 litreve lin-15 tüm inşaat Ca2 + görüntüleme ve optogenetic deneyler için yeni suşların basitleştiren kromozom X, sağ yarısında yer alır.

Çünkü pozlama süreleri kısadır ve görüntüleri 20 Hz’de toplanır, GCaMP5 ve mCherry sinyalleri parlak olması gerekir. Gürültülü Ca2 + kayıtları için en olası açıklaması loş Floresans zayıf muhabir ifade tarafından neden var. Organizatör da yansıması bölge için makul belirli olmalıdır. HSN hücre vücut ve vulva kaslar üzerine sinapslarda vücut ortasında olduğundan, baş ve kuyruk nlp-3 organizatörü ek ifade genellikle görüş alanı dışında olduğunu ve ek filtreler kullanarak hariç Ratiometric Nefelometri yazılım. GCaMP5 floresan sonuç fiili değişikliklerden değişimler intrasellüler Ca+ 2gözlemlenen emin olmak için denetim transgenes GCaMP5 yerine GFP ifade bağımsız olarak hazırlanmalı ve26analiz. Daha yeni Ca2 + gazetecilere farklı Ca2 + hassasiyetleri, kinetik ve renkleri görüntüleme araçları kullanılabilir seçenek genişletilmiş, ama her yeni muhabir Ca2 +kullanarak doğrulanması gerektiğini-büyük küçük harf duyarlı floresan değişken14 ,16.

Medya:

NGM plakaları görüntüleme için yüksek kaliteli agar ile hazırlanmalıdır. Daha düşük kalite agar tamamen ısıyla, küçük parçacıklar Bu dağılım görüntüleme ve arka plan Floresans artan sırasında ışık bırakarak üzerine eriyecektir değil. Moleküler Biyoloji sınıf özel yerine kullanılabilir ancak eşdeğer plaka sıkılığını korumak için eklenmiş tutar azaltılmalıdır.

Karşılaştırmalar için diğer montaj yöntemleri:

Resim etkinliğinde yumurta döşeme davranışı devre önceki yaklaşımlar bir özel rampasına tutkal ile immobilize solucan kullandık. Bu koşullar, devre aktivite ve davranış yumurta döşeme altında kültür medya Osmolarite8,10,44,45bir azalma olmadan tercih değil. Son kanıtlar birkaç solucan davranışları hücre faaliyet serbestçe hayvanlar davranmak görülen için immobilize hayvanlarda gözlenen ilişki hakkında sorularınız yükselterek gezisidir devlet tarafından modülasyonlu gösteriyor. Biz son zamanlarda yumurta atarken devre etkinlik beklenmedik bir şekilde hareket26,27ile aşamalı göstermiştir. Benzer şekilde, RIA interneuron sinyal compartmentalized Ca2 + duyusal sinir hücreleri ve baş motor nöronlar aktivitesinden hareketleri46yiyecek arama sırasında bütünleştirir. Dışkılama davranış da kesin ve klişeleşmiş değişiklik hayvan atık47kovma önce onların yiyecek spot uzak taşımak sağlar hareket ile eşlik eder. Birlikte, bu sonuçları kısa kayıtları devre faaliyet immobilize hayvanlardan temelde farklı özgürce hayvanların davranış elde olabilir öneririz.

Doğrudan bir coverslip altında olmasına rağmen solucan’ın davranış standart NGM Tabaklarda görülen benzer. Koydu yumurtalar çatlamaya devam edecek ve yetişkin (veri gösterilmez) büyümeye L1 larva yatırılır gıda az miktarda sağlar. Büyük agar Öbek boyutu makul gaz değişimi için sağlar ve her ne kadar çok fazla yemek arka plan Floresans artacak dehidratasyon, direnir. Bu yöntem en iyi yetişkin için çalışsa da, teknik resim L4 hayvanlar için de kullanılabilir. Öyle ki daha küçük larvalar sürünerek zorluk ve sık sık hareketli bir yetişkin sonrasında tuzağa olsun yığın ve coverslip arasındaki sulu katman kalınlığı be.

Bu montaj tekniği sınırlamasından doğrudan mekanik veya kimyasal uyarımı hassas bölgeler için vücudun zor olmasıdır. Desenli aydınlatma teknikleri son gelişmeler baş veya kuyruk ifade mikrobiyal opsins ayrı aydınlatma ile ayrı uyarma ve GCaMP/mCherry floresan midbody48,49olarak algılanmasını sağlar. Sonuç olarak, optogenetic yaklaşımları kullanarak bu sorunu aşmak mümkün olabilir.

Karşılaştırmalar için diğer Ca 2 + Yaklaşımlar görüntüleme:

Bu yöntem inşaat peki sitoplazmik Ca2 + tek gelen değişiklikleri kaydetmek için hücreleri ve onların sinaptik bölgeler çözüldü. Gerçek zamanlı, hacimsel görüntüleme nöronların başından son zamanlarda hücre kimliği ve nucleoplasmic kalsiyum50,51,52değişimler quantitate için hücre çekirdeği konumunu kullanarak elde edilmiştir. Arasındaki nükleer ve sinaptik Ca2 + ilişki belirsizdir. Bizim verileri hücre soma (şekil 4 d) uzak presynaptic termini, HSN intrasellüler Ca2 + en göze çarpan değişiklikler gerçekleşir göstermektedir. HSN ve VC nöronlar presynaptic termini postsinaptik vulva kas26yılında katıştırılır. Öyle olacağını olup olmadığını yeterli çözünürlükte bile disk veya hafif levha teknikleri presynaptic Ca2 + sinyalleri belirli hücrelere somatik kalsiyum hücre kimliği için bir şekilde dayanarak olmadan atfetmek için iplik ile Z boyut belli değil . Teknikleri kullanarak açıklanan burada, her 10 min, iki kanallı 12,001 ile kayıt 256 x 256 piksel 16 bit TIFF görüntüleri ~ 4 GB. Oranı ve yoğunluğu modüle oranı dosya boyutunu Çift Kanal ~ 8 GB. Her iki genotip (vahşi-tipi ve deneysel) 10 hayvan kayıt tipik bir deney yaklaşık 150 GB birincil veri üretir ve toplamak ve analiz etmek için 20 h gerektirir. Hacimsel analizleri timepoint başına 10 Z dilimleri ile daha fazla veri ve analitik zaman, neden o kadar az bu tür çalışmalar tamamlanmıştır açıklayan bir büyüklük gerektirir.

Donanım:

Biz kayıt ve görüntü sıralarını ile yüksek performanslı çift işlemci istasyonlarında analiz (Örneğin, oyun) ekran kartı, RAM, 64 GB ve yüksek performanslı katı hal sürücüler ( Tablo malzemelerigörmek). Veri ağ yedek dizisi (RAID) bağımsız diskler üzerinde depolanan ve bir off-site veri merkezinde bulut için sırt yukarıya.

Yüksek güç kullanarak LED’ler pulsed Floresans uyarma için metal halide veya cıva tabanlı ışık kaynakları üzerinden collimated tavsiye ediyoruz. Birkaç piyasada bulunan çok renkli LED sistemleri bulunan yerlerde geçerlidir. Bazı bu LED sistemler daha yüksek bir ayarlıyoruz maliyet varken, onlar bir uzun ömürlü (> 20.000 h) var, aynı anda dört veya daha fazla farklı fluorophores heyecanlandırmak ve düşük gecikme süresi (10-300 µs geçiş bir seri ve/veya TTL arabirimi kullanarak hassas zamansal kontrol sunuyoruz zaman). Uyarının harekete geçirilmesine karşılık ne zaman veri aslında toplanmakta olan örnek yalnızca ışıklı sağlar. Biz genellikle 10 ms pozlama her 50 ms (% 20 görev oranı) kullanın. Bu fototoksisite azaltır ve Hareket Bulanıklığı daha önce raporlanmış43olarak görüntü yakalama sırasında.

SCMOS kameralar hız ve küçük, hassas piksel büyük dizi için kullanın. Bir EM-CCD kamera daha pahalı bir alternatif olmakla beraber ‘bloom’ etkileri yakalanan photoelectrons Bitişik piksellerin dökülmesini neden olabilir. Yeni arka ışıklı sCMOS kamera EM-kendilerini benzer fotosensitivite önemli ölçüde azaltılmış pahasına var. Ne olursa olsun hangi sensör kullanılır, GCaMP5 ve mCherry kanalları aynı anda alınması gerekir. Solucanlar hareketli sıralı yakalama kötü kayıtlı görüntüleri ratiometric Nefelometri için uygun olmayan yol açar. Çift kanallı görüntüleme bölme sonra tek kamera gerçekleştirilebilir bir resim splitter (Şekil 2) veya iki özdeş kamera kullanarak kanalları. 16-bit görüntüleri dinamik aralığı 8-bit görüntüleri doğru ratiometric Nefelometri için önerilir. Aydınlık alan solucan davranış için biz büyük 2 x 2 dönüştüm 1024 x 1024 8-bit görüntü sıralarını JPEG sıkıştırma sonra yakalamak için bir 1 inç 4.1 MP yakın kızılötesi USB3 kamera ile çekim. Daha yeni mikroskop modellerde kullanılabilir daha büyük FOV 20 x sadece hafif (şekil 4E) vinyet ile 0,63 x demagnification sonra görüntülenmeyecektir yetişkin bir solucan sağlar.

Standart TTL gerilim sinyalleri aydınlatma ve çerçeve yakalama eşitlemek için kullanmanızı öneririz. Farklı yazılım programları içinde olası gecikmeleri nedeniyle kullanıcıların Floresans kamera tetikleyici çıkışlarını ile master olarak ile diğer cihazlar sürüş TTL çıkış yapılandırma önerilir. Bu şekilde, aydınlık alan ve sahne konum bilgilerini her Ca2 + ölçüm için toplanacaktır.

Yarık veya genellikle paylaşılan confocal tesislerinde bulunan rezonans noktası tarama confocal mikroskoplar de ratiometric Ca2 + görüntüleme sırasında mükemmel performans vermek. Bu tür aletleri aydınlık alan24ile birlikte iki veya daha fazla Floresans Kanallar yakalamak için kullanılabilir. Bu durumda, confocal iğne deliği maksimum çapına açılmalıdır ve spektral dedektörü GCaMP5, mCherry ve kızılötesi aydınlık alan sinyalleri ayırmak için kullanılmalıdır. Bu hafif bir kalın koleksiyonundan en üst düzeye çıkarır (~ 20 µm) hala odak floresan reddedilmesi izin verirken dilim. Bir eksik yanı daha küçük FOV ve donanım ve yazılım özelleştirme için daha fazla kısıtlama var.

Yazılım:

Pek çok üretici sevk ve giriş ve çıkışlarını uyarının harekete geçirilmesine karşılık yapılandırma da dahil olmak üzere özel mülk yazılımla onların kameralar ve mikroskoplar yükleyin. Özellikleri ve bu yazılımın performans kayıt sırasında değişebilir. Solucanlar hızlı hareket izlemek için zor olabilir çünkü düzgün ve istikrarlı 20 Hz değerinde olması gerekir kayıt sırasında ekran görüntü. Performansı artırmak için görüntü sıralarını geçici olarak RAM’de deneme sonunda kaydedilen davranışsal ilgili alt kümeleri ile kaydedilebilir. Bu iki kanallı görüntü sırası dosyalarını içe Ratiometric Nefelometri yazılım aktarmak için açık görüntü sitometresi standart biçime (.ics) dönüştürülebilir. OME-TIFF daha yeni bir açık kaynak resim biçimi olsa da farklı yüklemeler TIFF görüntü sıralarını 4 GB’den büyük kaydedemedi olabilir.

Bir ana Nefelometri boru hattı oranı kanal ve sonra mCherry floresan hücreleri ilgi bulmak için kullanarak bir tarafsız görüntü segmentasyonu yordamı nesil özelliğidir. Her eşya nesnesinin nesne boyutu, XY centroid konum ve en düşük düzeyde, demek ve en fazla Floresans yoğunluk değerleri (oranı kanal da dahil olmak üzere) her kanal için hesaplanır. Birlikte, bu değerler intrasellüler Ca2 + ‘ da her timepoint kayıt değişiklikleri quantitate için kullanılır. Her timepoint için nesne ölçümleri sonra daha sonraki analizler için a.csv dosyası olarak dışa aktarılır.

Burada açıklanan protokol büyük bir sınırlama verileri farklı şekillerde yazılım ürünlerinin bir patchwork yoluyla taşıma bağımlılık olduğunu. Ek bir tahriş bazı yazılım açık kaynak ve özgür diğerleri kapalıyken, pahalı ve düzensiz güncelleştirilmiş olmasıdır. Önemli bir gelişme kullanın veya benzer düzeyde performans ve rahatlık-in-kullanma edinme üzerinden analiz için sağlayan bir yazılım (ideal olarak açık kaynak) parçası geliştirmek olacaktır. Yukarıda da belirtildiği gibi ratiometric analiz bir deney tamamlamak için gereken saat ve dosya boyutu iki katına çıkar. Bonsai resimleri ve diğer veri akışlarını toplanan ve analiz için’gerçek zamanlı olarak, önemli ölçüde iyileştirilmesi üretimi sağlayacak gibi kullanıcı tarafından özelleştirilebilir çerçeveler entegre kamera sürücüleri nesil.

Gelecek:

Biz genellikle el ile solucan hareketlerini takip ederken, kızılötesi parlak veya karanlık alanlı kayıtları tespit solucan centroid izlenmesine ek görüntü işleme kapalı döngü ayarlama sahne pozisyon sağlamak ve otomatik düğümleri için izin vermelidir izleme (şekil 3 ve veri gösterilmez). Bu yöntem ile elde edilen floresan kayıtları çoğunluğu karanlık ve biyolojik veri ilginç yoksun olduğunu. Sensör üzerinde veya gerçek zamanlı sonrası edinme görüntü görüntü sıralarını ilgili nesneleri kırpma teknikleri işleme yüksek Uzaysal çözünürlük için izin ve özellikle ek Z-dilimler her için toplanan eğer veri analizi potansiyel hızlandırmak timepoint etkinlik devre tüm ön ve postsinaptik hücre içinde görselleştirmek için.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NINDS KMC (R01 NS086932) için bir hibe tarafından finanse edildi. LMN NIGMS IMSD programı (GM076419 R25) hibe tarafından desteklenmiştir. Suşları C. elegans genetik Merkezi, hangi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen bu çalışmada kullanılan. James Baker ve Mason Klein yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz.

Materials

C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25×36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB Mean Ratio and XY centroid script Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders:  analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units):  time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces.
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -. C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).

Tags

Ratiometric Calcium ImagingCaenorhabditis ElegansHSN NeuronBehavioral NeuroscienceGCaMP5MCherryNematode Growth MediumOP50 BacteriaVulvaInverted MicroscopeInfrared FilterVideo AnalysisStage XY Stage Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image