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Neuroscience

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56911
, , , , ,
1Neuroscience Program,University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology,University of Miami

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation de codé génétiquement Ca2 + reporters de consigner les changements dans l’activité neuronale en comportement vers Caenorhabditis elegans .

Abstract

Il est devenu de plus en plus évident que l’activité circuits neuronaux en comportement animaux diffère considérablement de celle observée chez les animaux anesthésiés ou immobilisés. Très sensibles, génétiquement encodés reporters fluorescents de Ca2 + ont révolutionné l’enregistrement de la cellule et l’activité synaptique en utilisant des approches optiques non invasif chez les animaux de se comporter. Lorsqu’il est combiné avec la génétique et optogenetic techniques, les mécanismes moléculaires qui modulent l’activité cellulaire et circuit au cours d’un comportement différent États peuvent être identifiés.

Nous décrivons ici les méthodes ratiométrique Ca2 + imagerie des neurones en comportement librement vers Caenorhabditis elegans . Nous démontrons une technique de montage simple qui doucement vers de superpositions de plus en plus sur une gélose de nématode croissance Media (NGM) standard bloquent avec une lamelle de verre, permettant des animaux à être enregistré à haute résolution au cours de la libre circulation et le comportement. Avec cette technique, nous utilisons le sensible Ca2 + journaliste GCaMP5 pour enregistrer les modifications en intracellulaire Ca2 + dans l’Hermaphrodite spécifique des neurones sérotonergiques (HSNs) car ils roulent le comportement de ponte. En exprimant co mCherry, un Ca2 +-indépendante de la protéine fluorescente, nous pouvons suivre la position de la rsh dans ~ 1 µm et correcte des fluctuations causées par les changements de focus ou mouvement de fluorescence. L’imagerie simultanée, infrarouge fond clair permet pour comportement d’enregistrement et de suivi des animaux à l’aide d’une platine motorisée. En intégrant ces techniques microscopiques et les flux de données, nous pouvons enregistrer Ca2 + activité dans le circuit de Ponte de c. elegans comme il progresse entre les États actif et inactif de comportement sur des dizaines de minutes.

Introduction

Un objectif central des neurosciences est de comprendre comment les neurones communiquent dans les circuits de comportement animal en voiture. Circuits neuronaux intègrent un éventail de divers indices sensoriels afin de changer l’activité circuit, ainsi conduire les changements de comportement nécessaires aux animaux pour répondre à leurs environnements. Le nématode c. elegans, a un système nerveux simple avec 302 neurones dont les connexions synaptiques ont été entièrement cartographiée1. En outre, les gènes qui codent pour des protéines impliquées dans la neurotransmission sont hautement conservées entre c. elegans et mammifères2. Malgré la simplicité anatomique de son système nerveux, il affiche un Répertoire complex de comportements conservés offrant une plateforme fertile pour comprendre comment les neurones régulent comportement3.

C. elegans est favorable à l’application d’un large éventail d’approches comme la manipulation génétique, l’ablation laser cell, techniques électrophysiologiques, comme in vivo optique d’imagerie4,5. De récentes études ont produit des cartes détaillées de la neurotransmetteur majeur chez c. elegans , y compris les cholinergiques et réseaux de neurones GABAergiques, les systèmes de signalisation. Ces études, ainsi que des études en cours à la carte de l’expression de tous les neurones G-récepteurs couplés aux protéines placent ce modèle dans une position unique pour tirer parti structural très détaillée et la connectivité neuronale fonctionnelle des cartes afin de bien comprendre comment ces signal de neurotransmetteurs différents par le biais de récepteurs différents et les délais de route différents aspects du comportement animal.

Afin d’étudier les profils d’activité neuronale dynamique dans n’importe quel système, une condition préalable essentielle est de développer des méthodologies robustes pour enregistrer l’activité de neurones individuels ou circuits tout au cours de comportements. Particulièrement importante est la susceptibilité de ces approches optiques pour visualiser l’activité présynaptique qui entraîne la fusion des vésicules synaptiques. Rapides et hautement sensibles reporters fluorescents d’intracellulaire Ca2 +, ainsi que la disponibilité croissante des photo-récepteurs sensibles, ont révolutionné l’enregistrement de la cellule et l’activité synaptique chez l’animal éveillé, vivant au cours de comportement. Parce que des principaux résultats de l’activité synaptique électrique doit régler les canaux Ca2 + , variations intracellulaires Ca2 + sont censées signaler fidèlement les modifications pertinentes sur le plan comportemental dans l’activité des cellules.

Dans cette étude, nous présentons une méthode pour exécuter ratiométrique Ca2 + imagerie dans les neurones sérotoninergiques HSN moteur qui favorisent le comportement de ponte dans c. elegans6,7. Cette approche s’appuie sur des efforts antérieurs de visualiser Ca2 + activité chez c. elegans et le circuit de ponte au cours de comportement5,8,9,10,11 . La méthode permet de corréler simultanément les changements observés dans l’activité cellulaire/circuit avec les événements de Ponte, ainsi que changements dans l’État locomoteur animal. Bien que cette approche nous permet d’étudier l’activité dans les vers adultes, œuvre inédite dans notre laboratoire montre que cette approche peut être étendue aux animaux juvéniles au quatrième (L4) stade larvaire ainsi. Il est probable que l’activité d’autres neurones de c. elegans qui fonctionnent dans les circuits distincts et comportements doit être de même accessible avec cette technique. Autre développé récemment rapide Ca2 + indicateurs avec non-cumul des spectres d’émission12,13,14,15,16, optogenetic outils17 et génétiquement codé optiques indicateurs de tension de membrane18, devrait nous permettre d’effectuer des enquêtes « tout-optique » pénétrants sur comment les changements dans l’activité des circuits neuronaux conduire États un comportement distinct.

Protocol

1. souches, de la Culture médiatique et montage d’animaux Poussent vers c. elegans à 20 ° C sur standard 60 mm moyen de croissance de nématode (NGM) boîtes de gélose ensemencées avec OP50 e. coli alimentaire bactérienne19. Préparer deux plasmides pour chaque promoteur de cellule spécifique d’intérêt : l’un, expression de GCaMP5 d’enregistrement intracellulaire Ca2 +et le second, expression de mCherry pour permettre ratiométrique quantification des changements de fluorescence GCaMP5 de conduite au volant et simplifier la mesure et la constatation de l’objet.Remarque : GCaMP5:mCherry ratiométrique imagerie corrige les fluctuations GCaMP5 fluorescence qui résultent de l’évolution de mouvement focus et animal, pas de réelle évolution Ca intracellulaire2 +. Injecter des plasmides exprimant de GCaMP5 et de mCherry ainsi que le plasmide pL15EK de marqueur visible de sauvetage dans les gonades de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animaux mutants et récupérer non-Muv lin-15(+) animaux exprimant GCaMP5 et mCherry d’un transgène haute-copie20,21,22. L’arrière-plan mutant lite-1 permet de réduire l’évitement de la lumière bleue comportement23,24. Intégrer les transgènes aux chromosomes à réduire un mosaïcisme et simplifier la génération de souches mutantes composé25.Remarque : La souche LX2004 décrite ici porte un transgène haute-copie intégrée qui exprime GCaMP5 et mCherry dans les HSNs provenant du promoteur de la PNL-3 (voir Table des matières)26,27, 28 , 29. le promoteur de la PNL-3 a été trouvé à forte expression de lecteur dans les HSNs L4 fin des animaux adultes sans causer des défauts importants en développement HSN ou le comportement de ponte par rapport aux autres promoteurs testés (e.g.,tph-1, EGL-6et unc-86). Cette souche et autres qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les neurones moteurs épinière ventrale (VC), muscles vulvaires et uv1 cellules neuroendocrines sont disponibles depuis le centre de génétique de Caenorhabditis et détails de sa construction ont été décrites 27. Appliquer OP50 alimentaire bactérienne d’une gélose ensemencée au NGM au fond d’un ver platine pick et utilisez-la pour transférer ~ 20 animaux L4 LX2004 fin qui expriment GCaMP5 et mCherry dans les HSNs provenant du promoteur de la PNL-3 . Veiller à ce que la vulve en développement apparaît dans un stéréomicroscope comme une tache claire sombre entourée d’un croissant blanc. Incuber les animaux à 20 ° C pendant 24 à 40 h. Après l’incubation, appliquer OP50 le prélèvement et le transfert ~ 3 vers à une plaque non ensemencée de NGM, laissant une petite quantité de nourriture derrière pour les vers à se nourrir pendant la formation image. Assurer une alimentation suffisante, car trop peu de nourriture bactérienne va encourager les vers à errer loin du centre de la plaque alors que trop de nourriture augmentera la fluorescence de fond et provoquer une hypoxie. Utilisez une spatule plate arrondie pour couper un ~ 20 x 20 mm, morceau de la plaque portant les vers et transférer le morceau face vers le bas sur le centre d’un lamelle couvre-objet propre 24 x 60 mm #1.5 (Figure 1). Démarrez l’application d’un côté pour empêcher les bulles d’être piégés sous la lamelle et interférant avec l’imagerie. Appliquer une lamelle de 22 x 22 mm #1 vers le haut du segment pour réduire le collage et l’évaporation. 2. configuration matΘrielle et Instrumentation Placer la mise en scène, vers transgéniques sur la scène d’un microscope inversé avec un ≥ 0,7 numérique ouverture Plan-Apochromat 20 x stade XY objectif, motorisé contrôlable avec un joystick, un diviseur de l’image et fluorescence filtres pour GCaMP5 simultanée et mCherry excitation et d’émission, caméras pour fond de fluorescence et infrarouge clair d’imagerie et un système d’éclairage à la Diode électroluminescente (del)-triggerable (Figure 2A).Remarque : Un séparateur de faisceau de 80/20 envoie 80 % du signal image de la caméra à fluorescence et 20 % à la caméra fond clair. Un microscope vertical peut également être utilisé, mais le morceau NGM doit être placé entre une lame de verre et la grande lamelle en l’espèce. Les oculaires binoculaires permet de sélectionner un ver pour l’imagerie. Lorsqu’un animal est sélectionné, faites glisser le filtre infrarouge en place au-dessus du condenseur. Déclencheurs de transistor-transistor logic (TTL) Fixez les câbles coaxiaux de chacune des trois lignes de sortie TTL déclencheur sur la caméra à fluorescence. Connectez la première sortie à l’entrée BNC #3 du système d’éclairage LED. Connectez la sortie deuxième à un adaptateur BNC « banane » vert et bruns fils du connecteur 8 broches GPIO au GPIO entrée #3 (4 broches) et sol (broche 5) de la caméra infrarouge, respectivement. Connectez la sortie de troisième à l’adaptateur BNC « banane » avec des fils de raccordement à l’entrée numérique #8 et au sol dans le dispositif d’acquisition numérique (Figure 2B). Dispositif d’acquisition numérique (DAQ) Connectez la carte microcontrôleur DAQ (voir Table des matières) à l’ordinateur via un câble USB. Mise à jour le firmware avec la norme Firmata protocole (voir Table des matières) et configurer le port USB pour communiquer à 57600 bauds. LEDs Lancez le logiciel de contrôleur de LED (voir Table des matières). Changez le Mode de déclenchement de « continue à « Fermé » et sélectionner le déclencheur canal 3′ pour les deux LEDs nm 470 et 590. Allumez et entrez les voyants d’alimentation pour chaque LED (p. ex., ensemble le 470 nm LED à 20 % et la LED nm 590 à 40 %). Exécutez le script « XY-scène-final » en bonsaï (voir Table des matières) de communication série-stade30. Cliquez sur le nœud « CsvWriter » gris, puis sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer l’enregistré X et Y organiser des informations (Figure 3). Appuyez sur la flèche verte dans la barre d’outils pour initialiser le DAQ.Remarque : Le script démarre l’enregistrement de la position X et Y de scène quand la caméra à fluorescence envoie un signal TTL. Ce script affiche quatre colonnes de données : encadrer le nombre, X position (µm), la position Y (µm) et l’intervalle entre les images (s). Dans la caméra infrarouge, logiciel d’enregistrement (voir Table des matières) sous « Modes de vidéo personnalisée », sélectionnez « Mode 1 » (binning 2 x 2, 1 024 x 1 024 pixels), et « Pixel Format Raw 8″. Sous ‘ Trigger / Strobe “, la ligne d’entrée de déclenchement (GPIO) la valeur « 3 », la polarité à « High », « Mode » à « 14 ». Activer/désactiver « Activer » pour arrêter l’acquisition de cadre jusqu’à la réception d’un signal de déclenchement TTL. Laisser cette fenêtre ouverte, cliquez sur le bouton rouge de « Record » sur la barre d’outils de la vue caméra principale. Sélectionnez le dossier pour les séquences d’images être sauvé. Sélectionnez le mode d’enregistrement « Tamponnée » et enregistrez des « Images » au format JPEG. Cliquez sur « Start Recording » pour initialiser l’acquisition. Appareil photo et image répartiteur de fluorescenceNOTE : GCaMP5 et mCherry canaux fluorescence doit être prélevés en même temps pour assurer l’enregistrement d’image adapté pour le dosage ratiométrique. Un séparateur d’image permet l’acquisition de deux canaux de la fluorescence GCaMP5 et mCherry sur un capteur. Dans l’onglet « Capture » du logiciel d’acquisition de l’image (voir Table des matières), temps d’exposition défini à 10 ms, binning à x 4 et profondeur de l’image 16 bits. Sélectionnez un sous-tableau de caméra centrée de 512 pixels de large par 256 pixels de haut. Cliquez sur « Afficher les Options de déclenchement sortie » et définissez tous les déclencheurs de « Positif ».Remarque : L’acquisition de données ne peut parfois manquer de TTL déclencheurs s’ils sont 10 ms ou moins. Vérifiez que « Trigger 1′ et « Trigger 2’ sont sur « Exposition » tandis que « Trigger 3″a la valeur « Programmable » avec une « période » de Mme 25 sous l’onglet « Séquence », sélectionnez « Time Lapse » avec un « champ Delay1 » de 50 ms pour recueillir des images à 20 Hz. Sélectionnez « Enregistrer sur tampon temporaire ». PMT acquérir et laser intensité durant l’imagerie confocale trois canaux Régler le gain PMT pour la fluorescence de fond est à un niveau juste au-dessus du minimum (niveau de noir). Augmenter la puissance de laser (vert) 561 nm jusqu’à ce qu’un seul pixel saturé de 12 bits ou 16 bits est observé à l’extrémité présynaptique dans le canal de mCherry. Régler intensité de laser (bleu) 488 nm afin que GCaMP5 fluorescence est visible à l’extrémité présynaptique au-dessus de fond. Ce paramètre faible empêche la saturation des pixels GCaMP5 lorsque la fluorescence augmente en réponse aux transitoires de forte Ca2 + . Ouvrir le trou d’épingle confocal complètement afin de maximiser la lumière capture. 3. ratiométrique Ca2 + imagerie et enregistrement de comportement Sous l’onglet « Séquence » dans le logiciel d’acquisition de fluorescence, cliquez sur « Démarrer » lancer l’enregistrement. Suivre le ver avec le joystick, gardant les cellules et les synapses d’intérêt en bref et dans le centre du champ de vision (FOV). Cliquez sur le bouton « Statistiques » dans la fenêtre d’histogramme pour afficher les statistiques de pixel de chaque canal. Ajuster la puissance de LED afin d’assurer une fluorescence maximale pixel unique mCherry à l’extrémité présynaptique de ≥ 8 000 chefs d’accusation (~ 4 000 photoélectrons), donnant un ~ 12 bits plage dynamique plus haut fond (~ 100 photoélectrons). GCaMP5 signaux au terminus présynaptique au cours du repos Ca (faible)2 + devrait être autour de ~ 2 500 counts – juste visibles au-dessus d’un fond. Enregistrement jusqu’à un état actif Ponte ; en général, cela produit toutes les 20-30 min dans un ver de type sauvage7. Enregistrez un sous-ensemble de 10 min (12 001 cadres), 6 000 cadres avant et après le premier événement de Ponte (cadre 6 001). N’oubliez pas de garder le même sous-ensemble d’images de fond clair de ver, comportement et points de position allure XY, ou la synchronisation précise des flux de données seront perdue. Utilisez ImageJ et le plugin BioFormats (voir Table des matières) pour convertir des séquences d’images au format Image Cytometry Standard (.ics) afin qu’il puisse être importé dans le logiciel ratiométrique quantification. 4. l’image Segmentation et analyse Quantitative Importer des séquences d’images dans le logiciel ratiométrique dosage (voir Table des matières). Cliquez sur « Auto contraste » dans le menu « Outils » et régler le contraste de chaque canal d’établir noir approprié (~ 1 800) et blanc niveaux (10 000). Sélectionnez « Modifier les couleurs… » dans le menu outils pour confirmer que les affectations de couleur pour le canal GCaMP5 et mCherry sont correctes (Figure 4A – C). Faites un clic droit sur la série chronologique dans l’onglet « Séquence » et mettre à 20 images/s et 1,25 µm/pixel. Sélectionnez « Ratio » dans le menu « Outils » et sélectionnez « GCaMP5 » pour « Canal A » et « mCherry » pour « Canal B ». Cliquez sur « Calculer » à côté de « Seuil » pour soustraire l’arrière-plan de chaque séquence d’images. Sélectionnez « Appliquer un arc-en-ciel LUT au canal ratio ».Remarque : Pour un enregistrement avec un ratio de base moyenne de 0,3 (faible Ca2 +) et un ratio maximum de 2-3 (forte Ca2 +), une table de recherche appropriée serait de 0 (bleu) de 1 (rouge). Générer un canal de Ratio de moduler l’intensité à l’aide de la chaîne de mCherry (Figure 4D). Le canal de Ratio d’intensité modulée est une image des millions-de-couleurs où la couleur du ratio est mappée sur la luminosité du canal mCherry. Sous l’onglet « Mesures », créez un protocole de recherche d’objet en faisant glisser l’outil « Trouver des objets à l’aide d’intensité » pour le volet « Protocole ». Cliquez sur le « pignon » pour définir la fenêtre de mCherry valeurs d’intensité et de trouver des objets. Sélectionner l’intensité des valeurs ≥ 2 déviations standard (SD) au-dessus de fond (par exemple, le seuil de ~ 2 500, limite supérieure de 65 535). Vérifiez que la terminaison présynaptique est détectée et que « mettre à jour automatiquement vos commentaires » est sélectionné dans le menu de mesures.Remarque : Le logiciel peut également identifier des objets par leur écart d’arrière-plan à l’aide d’un protocole connexe « SD intensité. » Toutefois, si un objet particulièrement lumineux pénètre dans le champ de vision, il peut considérablement changer l’intensité moyenne pendant ces intervalles, affectant les seuils d’intensité utilisées pour trouver le HSN. Cette variabilité n’aura pas lieu si les valeurs d’intensité brute sont utilisées pour trouver des objets. Ajouter des filtres supplémentaires ciblant uniquement le canal mCherry (taille, intensité Max, etc.) si nécessaire afin d’exclure les objets indésirables comme la tête, la queue et gut fluorescence. Sélectionnez « Rendre mesure Item » dans le menu de Mensurations et choisissez « Tous les points. »Remarque : Cela s’exécute le protocole, toutes les mesures d’écriture dans un fichier de valeurs séparées par des virgules (.csv) qui doit être exporté à l’aide de la commande « export » dans le menu fichier. Ouvrir le fichier exported.csv et copiez validant, zone (µm2), moyenne (rapport / canal), centre de gravité X (µm) et données centroïde Y (µm) dans une nouvelle feuille. A.csv fichier d’exportation sans en-têtes de colonne. Le logiciel ratiométrique quantification peut qualifier un ou plusieurs objets par validant une cellule d’intérêt. Pour recombiner ces objets, utiliser un script personnalisé « AnalzyeGCaMP_2017.m ».Remarque : Le script aussi identifie Ca2 + (ratio) des pics dans les données et enregistre le fichier a.csv de leurs points, les amplitudes de pic et largeur des pics. Il génère également des fichiers postscript pour les traces de ratio brut et annoté. Avec cette information, Ca2 + transitoire amplitude et intervalle inter transitoire doivent être déterminées. Ajouter la sortie X et Y les valeurs centroïde de chaque objet de fluorescence aux valeurs X et Y enregistrés par le script de XY-stade de bonsaï. Utiliser la position XY nette pour générer une trace de locomotion ver et pour calculer le déplacement de la cellule et de la vitesse qui accompagnent un comportement différent États31. Importer les images de fond clair enregistré dans ImageJ comme une pile virtuelle. Annoter les événements de ponte et autres comportements. Comparez le calendrier de ces événements avec Ca2 + pics de la trace de ratio.

Representative Results

La technique de montage simple décrite ici (Figure 1) provoque des changements minimes à l’environnement de la culture de L4 et adultes c. elegans tout en permettant à haute résolution d’enregistrement en comportement animal par une lamelle de verre (Figure 4). Synchronisation des sources de lumière LED, contrôleurs de scène et expositions de caméra permettant des recherches pour l’acquisition de plusieurs cours d’eau à 20 images/s jusqu’à 1 h. intermédiaire grossissement (x 20) avec les objectifs d’ouverture numérique élevée (0,7-0,8) fournit bonne résolution spatiale de la région synaptique dans le circuit de comportement Ponte, même avec 4 x 4 pixels binning (1,25 µm/pixel). Acquisition simultanée de signaux de fluorescence GCaMP5 et mCherry (Figure 4A, B) est utilisée pour générer une chaîne de pixels ratio qui compense les changements dans les mouvements des animaux et de se concentrer (Figure 4D). La terminaison présynaptique HSN est aussi grande que les nombreux organismes de cellule neuronales chez c. eleganset variations présynaptiques HSN Ca2 + peuvent être clairement visualisées. Le grand champ de vision de la caméra infrarouge fond clair permet au ver de s’être suivis manuellement pendant l’enregistrement (Figure 4E). Pour chaque animal, changements Ca intracellulaire2 + peut être corrélée avec les comportements évidents en fond clair imagerie, y compris la libération des œufs et des changements dans la locomotion (Figure 4E). Dosage du HSN Ca2 + et vitesse confirme que vers changent leur locomotion selon leur transition au comportement de ponte. Il y a des différences significatives dans la vitesse de la vis sans fin avant, pendant et après l’état actif Ponte (Figure 5A). Ce n’est pas causé par le bruit inhérent à l’imagerie ou le système de suivi. Zoom dans un événement de Ponte, on observe une forte variation GCaMP5 de fluorescence (ΔF/F) avant l’événement Ponte alors que mCherry fluorescence est relativement inchangé (Figure 5B). Les changements mesurés dans le rapport de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) montrent clairement un HSN Ca2 + transitoire ~ 4 avant s Ponte (Figure 5B). Parallèlement à la contraction musculaire vulvaire, un ralentissement évident de locomotion ver se produit que se termine avec le œuf libère. Les résultats précédents ont montré que les neurones cholinergiques du moteur VC, qui sont innervés par les HSNs, montrent pic d’activité durant les contractions du muscle vulvaire fort et au cours de le œuf version 8,10,27. Nous avons également montré qu’optogenetic activation des neurones VC entraîne un ralentissement immédiat de la locomotion, ce qui suggère que les neurones VC peuvent être activées par la contraction musculaire vulvaire, ralentissant ainsi locomotion jusqu’à la réception des commentaires de Ponte27 . L’imagerie et suivi de système décrite permet la visualisation de l’organisation spatiale du comportement de Ponte (Figure 5C). Comme précédemment indiqué, vers entrez pistes soutenues de locomotion avant juste avant l’ état actif32. Les vers passent la majorité de leur temps à chercher leur nourriture sur les bactéries au centre du segment agar. Avant l’entrée dans l’état actif, worms s’éloigner de la nourriture, ce qui coïncide avec l’apparition des transitoires de rares HSN Ca2 + . Activité HSN transitions puis en tir rafale, avecplusieurs très rapprochées HSN Ca 2 + transitoires qui soutiennent des événements de ponte. Les vers puis souvent demi-tour, reprendre la locomotion avant et pondent des œufs sur le chemin du retour vers leur position de départ près de la bactérie OP50. Nous supposons que changements dans local O2 et/ou la concentration de CO2 peuvent être influencer où les vers décident de jeter des œufs33,,34. La figure 1. C. elegans montage technique d’imagerie à haute résolution de l’activité circuit et du comportement de ponte. Haut, le montage final du côté. En bas, le montage final vu à travers le fond de la grande lamelle. Les flèches indiquent OP50 alimentaire bactérienne, vers c. elegans et oeufs, pris en sandwich entre le bloc de gélose NGM et la lamelle de grand 24 x 60 mm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 . Widefield ratiométrique Ca2 + imagerie et le comportement d’enregistrement sur un microscope à épifluorescence inversé. (A) position de la vis sans fin et le comportement est capturée en fond clair via un 20 x (NA 0,8) objectif Plan-Apochromat utilisant la lumière infrarouge (750-790 nm) (flèches violettes) émise par une lampe halogène à travers le morceau NGM. Une manette de jeu et la platine motorisée contrôleur sert à maintenir le ver dans le champ de vision pendant l’enregistrement. Position d’allure (Δx, Δy) est envoyée au PC par le port série. GCaMP5 et mCherry des protéines exprimées dans le ver sont excités à l’aide de 470 nm (flèches bleues) et 590 nm (flèches jaunes) Diodes électroluminescente (del). Émis GCaMP5 (vert flèches) et mCherry (flèches orange) fluorescence avec la lumière infrarouge passe à travers un miroir Dichroique multibande (voir Table des matières). Un séparateur de faisceau de 80/20 envoie 20 % de la lumière à travers un demagnifer x 0,63 pour capture sur une caméra CMOS de sensible à l’infrarouge (flèche violette). Les 80 % restants de la lumière est envoyé à travers l’orifice latéral du microscope à un répartiteur d’image qui sépare le GCaMP5 et mCherry fluorescence sur séparer les deux moitiés d’une caméra sCMOS tout en éliminant la lumière infrarouge fond clair. Les données de ces deux caméras sont transférées à un PC via câble USB3. Les ports de déclencheur de l’appareil de sCMOS de fluorescence (bleu) sont utilisées pour envoyer + 5V TTL déclenche le système d’éclairage LED, la caméra CMOS infrarouge fond clair, et le dispositif d’Acquisition numérique (DAQ). (B) Trigger 3 sortie signaux TTL sont détectés par l’acquisition de données sur la broche numérique #8 et envoyés à l’ordinateur via une connexion USB. Ces entrées numériques déclenchent un ‘ où XY’ commande série depuis un script de logiciel de Bonsai (XY-stade final) qui se lit position pour chaque image de fluorescence/infrarouge GCaMP5/mCherry capturé en scène X et Y. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Mise en page du script Bonsai communication série-stade XY-stade final. Le haut DigitalInput nœud (rose) lit déclencheurs TTL entrée en broche #8 de l’acquisition de données. Pour chaque tension TTL positive (verte), l’acquisition de données rend un timestamp (bleu) et écrit une chaîne de « Où XY ? » (rose) pour le contrôleur de scène via le port série (gris). Le nœud SerialStringRead (rose) lit que x et Y coordonnent la réponse du contrôleur de stage. Cette chaîne est ensuite convertie en microns et séparée en X et Y coordonnées de scène. Enfin, ces quatre filières sont combinées à l’aide d’un nœud de zip (bleu) et un fichier quatre column.csv est écrit : un nombre d’images des signaux TTL a reçu (nœud de la gamme, rose), les coordonnées X et Y et l’intervalle entre les points suivants (généralement ~ 50 ms Lorsque enregistrement à 20 Hz). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Représentant microscopie de fluorescence HSN et animaux fond clair lors de comportement de ponte. (A–D) Ratiométrique simultanée imagerie de fluorescence GCaMP5 et mCherry dans les HSNs juste avant la ponte. Termini présynaptique HSN est indiqués avec les pointes de flèches. (C) fusion de GCaMP5 et mCherry de fluorescence. Ratio (D) GCaMP5:mCherry modulé en intensité ; un rapport élevé (rouge) indique haute intracellulaire Ca2 + dans la terminaison présynaptique. (E) fond clair image du ver tout juste après que les œufs ont été pondus. Pointes de flèches indiquent les moitiés antérieures et postérieures de la vulve dont les œufs sont pondus. Barre d’échelle pour toutes les images est 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Enregistrement de HSN Ca2 + et locomotion vitesse durant le comportement de ponte. (A) les Traces de GCaMP5:mCherry des changements de rapport en réponse aux intracellulaire Ca2 + transitoires (ΔR/R ; rouge) ainsi que de la vitesse instantanée ver (µm/s, bleu). Événements Ponte sont indiqués par les flèches. (B) des Traces de fluorescence HSN GCaMP5 (vert ; ΔF/F), mCherry fluorescence (rouge ; ΔF/F), rapport de fluorescence GCaMP5:mCherry (black ; ΔR/R) et ver la vitesse (bleu) autour du moment de la ponte. (C) l’organisation spatiale des comportements de ponte et de la locomotion durant tout l’enregistrement de 10 min. La piste de ver a été obtenue d’après les informations de stade XY qui a été ajoutées au poste de centre de gravité de la HSN obtenu à partir de l’enregistrement de fluorescence mCherry. Le timing des transitoires HSN (cercles rouges), événements de Ponte (flèches noires) et le début et fin de l’enregistrement (losanges vert et bleu) sont indiqués. Barre d’échelle est 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Transgènes :

Parce que mCherry expression a été améliorée par l’insertion de codon-optimisation et intron (et plus disponible GCaMP journalistes ne l’ont pas), injecter ~ 4 fois le montant du plasmide exprimant le GCaMP5 afin d’assurer un niveau comparable de GCaMP5 fluorescence lors de forte Ca 2 + transitoires. Sauvetage de la mutation lin-15(n765ts) permet la récupération facile des animaux transgéniques avec des effets minimes sur la ponte et autres comportements35. Transgènes devrait être intégrée afin d’assurer une expression uniforme et imagerie conditions entre différents animaux25. Les marqueurs optionnels dont la résistance aux antibiotiques36,37 et le sauvetage de thermosensibles létaux38 devraient également fonctionner, mais, parce que les animaux non transgéniques sont morts, confirmation de l’intégration du transgène et homozygotie est plus difficile par rapport aux marqueurs qui présentent un phénotype visible25. Des marqueurs dominants qui perturbent la locomotion normale et diminuent de remise en forme, telles que rol-6(dm), devraient être évitées39. Imagerie dans le lite-1 mutant fond est essentiel de réduire réponses bleue légère fuite lors d’imagerie23,40,41. Mutation supplémentaire de gur-3, qui agit en parallèle au lite-1, peut réduire davantage le comportement résiduel et des changements physiologiques causés par la lumière bleue42. Idéalement, gur-3, 1-liteet lin-15 sont toutes situées sur la moitié droite du chromosome X, qui devrait simplifier la construction de nouvelles souches de Ca2 + imagerie et expériences d’optogenetic.

Parce que le temps d’exposition sont courtes et les images sont recueillies à 20 Hz, signaux GCaMP5 et mCherry doivent être lumineux. L’explication la plus plausible pour bruyant Ca2 + enregistrements est dim fluorescence provoquée par l’expression du Rapporteur faible. Promoteurs devraient aussi être raisonnablement spécifiques pour la région étant imagée. Parce que le corps cellulaire HSN et synapses sur les muscles vulvaires sont au centre du corps, expression supplémentaires provenant du promoteur de la PNL-3 dans la tête et la queue est généralement en dehors du champ de vision et ne peut être exclue à l’aide de filtres supplémentaires dans le Logiciel de quantification ratiométrique. Faire en sorte que les changements observés dans GCaMP5 résultat de fluorescence de changements réels dans intracellulaire Ca2 +, contrôle transgènes exprimant des GFP au lieu de GCaMP5 doivent être préparés de manière indépendante et analysé26. Plus récent Ca2 + reporters avec différentes sensibilités2 + Ca, cinétique et couleurs ont élargi le choix des outils disponibles d’imagerie, mais chaque nouveau journaliste doit être validée à l’aide du Ca2 +-indépendante de la variante fluorescent14 ,,16.

Médias :

Plaques NGM pour l’imagerie doivent être établis avec l’agar de haute qualité. Gélose de qualité inférieure ne se dissoudront pas complètement à l’autoclavage, laissant de petites particules éparpille la lumière au cours de l’imagerie et en augmentant la fluorescence de fond. Biologie moléculaire grade agarose peut être utilisé à la place, mais la quantité ajoutée devrait être réduite afin de maintenir la fermeté de la plaque équivalent.

Comparaisons à d’autres méthodes de montage :

Approches précédentes à l’activité d’image dans le circuit de comportement de Ponte ont utilisé vers immobilisée avec colle à un coussin de gel d’agarose. Sous ces conditions, l’activité du circuit et la comportement de Ponte ne sont pas favorisées sans réduction de milieux de culture d’osmolarité8,10,44,45. Récentes indiquent que plusieurs comportements de ver sont modulés par l’état de la locomotion, suscitant des interrogations sur la relation de l’activité des cellules observées chez les animaux immobilisés à celle observée en comportement librement les animaux. Nous avons récemment démontré que l’activité circuit Ponte est inopinément progressivement avec locomotion26,27. De même, compartimentée Ca2 + signalisation dans l’interneurone RIA intègre l’activité des neurones sensoriels et des motoneurones tête au cours de mouvements46de recherche de nourriture. Comportement de défécation est également accompagnée d’un changement de locomotion qui permet aux animaux de s’éloigner de leur place en quête de nourriture avant d’expulser les déchets47précis et stéréotypé. Ensemble, ces résultats suggèrent que les enregistrements brèves de l’activité de circuit d’animaux immobilisés peuvent être fondamentalement différents de ceux obtenus en comportement librement les animaux.

Bien qu’il soit directement sous un lamelle couvre-objet, comportement du ver ressemble à celle observée sur des plaques NGM standard. Allument œufs à éclore, et la petite quantité d’aliments déposés permet à la larve L1 à devenir des adultes (données non présentées). La taille de segment grande agar permet les échanges gazeux raisonnable et résiste à la déshydratation, bien que trop de nourriture augmentera la fluorescence de fond. Tandis que cette méthode fonctionne mieux pour les adultes, la technique peut également servir aux animaux L4 image. Cependant, l’épaisseur de la couche aqueuse entre le segment et la lamelle est telle que les larves plus petites ont du mal à ramper et peuvent souvent être retenus à la suite d’un mouvement adulte.

Une limitation de cette technique de montage qu’une stimulation mécanique ou chimique directe à des régions précises du corps est difficile. Développements récents dans les techniques d’illumination à motifs permettent la détection de la fluorescence de la GCaMP/mCherry dans le rappot48,49et l’excitation séparée de tête ou de queue-exprimé des opsines microbiennes avec éclairage séparé. Par conséquent, il peut être possible de surmonter ce problème en utilisant des approches optogenetic.

Comparaisons avec les autre Ca 2 + Méthodes d’imagerie :

Cette méthode fonctionne très bien pour l’enregistrement des changements cytoplasmiques Ca2 + du monophasé, résolu de cellules et leurs régions synaptiques. Imagerie en temps réel, volumétrique des neurones dans la tête a récemment obtenu à l’aide de la position des noyaux de la cellule pour l’identification de la cellule et à quantifier les changements de calcium nucléoplasmique50,51,52. On ne sait pas la relation entre nucléaire et synaptique Ca2 + . Nos résultats suggèrent que les variations plus remarquables HSN intracellulaire Ca2 + se produisent à des terminaisons présynaptiques loin le soma de la cellule (Figure 4). Les terminus présynaptiques de la RSH et les neurones de VC sont incorporés dans les muscles vulvaire postsynaptique26. On ne sait ne pas s’il y aurait une résolution suffisante dans la dimension Z même avec tourne disque ou techniques de la nappe de lumière d’attribuer les signaux présynaptiques de Ca2 + des cellules sans dépendre d’une certaine façon calcium somatique pour identification de la cellule . En utilisant les techniques décrites ici, chaque 10 min, les deux canaux d’enregistrement avec 12 001 256 x 256 images au format TIFF 16 bits de pixel est ~ 4 GB. Le ratio modulé ratio et l’intensité des canaux double la taille du fichier à ~ 8 GB. Une expérience typique d’enregistrement 10 animaux de chacun des deux génotypes (sauvage et expérimentales) génère près de 150 Go de données primaires et requiert 20 h pour recueillir et analyser. Analyses de volumétrie avec 10 tranches de Z par validant exigerait un ordre de grandeur plus de données et de temps analytique, à expliquer pourquoi si peu de ces études ont été réalisées.

Matériel :

Nous enregistrer et analyser les séquences d’images sur les stations de double processeur de hautes performances cartes graphiques (par exemple, les jeux), 64 Go de RAM, et disques de SSD hautes performances (voir Table des matières). Données devraient être stockées sur le réseau baie redondante de disques indépendants (RAID) et sauvegardées sur le nuage dans un centre de données hors site.

Nous recommandons l’utilisation haute puissance collimaté LEDs pour l’excitation de fluorescence pulsé sur halogénures métalliques ou de sources lumineuses à base de mercure. Il existe plusieurs systèmes de LED multicolores disponibles dans le commerce. Alors que certains de ces systèmes de LED ont un coût initial plus élevé, ils ont une longue durée (> 20 000 h) peuvent, en même temps exciter quatre ou plusieurs fluorophores différents et offrent un contrôle temporel précis à l’aide d’une série ou l’interface TTL avec une faible latence (passer de 10 à 300 µs temps). Déclenchement, s’assure que l’échantillon s’allume uniquement lorsque les données sont recueillies en fait. En général, nous utilisons une exposition de 10 ms toutes les 50 ms (taux de douane de 20 %). Cela réduit la phototoxicité et flou de mouvement lors de la capture de l’image, comme indiqué précédemment43.

Nous utilisons des caméras de sCMOS pour leur vitesse et leur large gamme de pixels petits, sensibles. Une caméra CCD-EM est une solution plus coûteuse, mais les effets « bloom » peuvent se traduire par des photoélectrons capturés de se jeter dans les pixels adjacents. Nouvelles caméras sCMOS rétro-éclairé ont une photosensibilité similaire des EM-CCD à un coût considérablement réduit. Sans se soucier capteur qui est utilisé, les canaux GCaMP5 et mCherry doivent être obtenus simultanément. Séquentiel capture en se déplaçant vers se traduira impropres à être ratiométrique dosage mal enregistrés images. L’imagerie bicanal est possible sur une seule caméra après fractionnement de canaux à l’aide d’un séparateur d’image (Figure 2) ou à l’aide de deux caméras identiques. La plage dynamique des images 16 bits est préférable à des images 8 bits pour le dosage précis ratiométrique. Pour les images de fond clair de comportement de ver, nous capturons utilisant une caméra 1 po 4,1 MP proche infrarouge USB3 pour intercepter les grandes séquences de 1 024 x 1 024 8-bit image jumelées 2 x 2 après compression JPEG. Le champ de vision plus grand disponible sur les modèles plus récents de microscope permet un ver adulte à visualiser à 20 x après 0,63 x demagnification avec seulement léger vignettage (Figure 4E).

Nous recommandons l’utilisation des signaux de tension TTL standard pour synchroniser l’illumination et la capture de l’image. En raison de latences potentiels dans les différents logiciels, nous vous recommandons d’utilisateurs configurer la caméra à fluorescence avec sorties maître avec sorties TTL conduite tous les autres appareils. De cette façon, les informations de position fond clair et stade seront recueillies pour chaque mesure de Ca2 + .

Fente ou résonantes point à balayage confocal microscopes on trouves généralement dans la salle de bains commune confocale donnent également excellente performance au cours de ratiométrique Ca2 + imagerie. Ces instruments peuvent servir à capturer deux ou plusieurs canaux de fluorescence avec fond clair24. Dans ce cas, il convient d’ouvrir le trou d’épingle confocal à son diamètre maximal, et un détecteur spectral doit être utilisé pour séparer les signaux infrarouges fond clair, mCherry et GCaMP5. Cela maximise la collecte lumineuse d’une épaisse (~ 20 µm) tranche tout en autorisant le rejet de la fluorescence d’out-of-focus. Un inconvénient est le champ de vision plus petit et davantage de restrictions pour la personnalisation de matériel et de logiciels.

Logiciel :

La plupart des fabricants livrer et installer leurs caméras et microscopes avec un logiciel propriétaire, y compris la configuration de déclenchement des entrées et sorties. Les caractéristiques et les performances de ce logiciel au cours de l’enregistrement peuvent varier. Parce que le déplacement rapide vers peut être difficile à suivre, image affichage pendant l’enregistrement doit être lisse et stable à 20 Hz. Pour améliorer les performances, séquences d’images peuvent être temporairement enregistrées dans la mémoire RAM avec des sous-ensembles pertinents sur le plan comportemental, enregistrés à la fin de l’expérience. Ces fichiers de séquence image deux canaux peuvent être convertis au format Image Cytometry Standard ouvert (.ics) à l’importation dans le logiciel ratiométrique quantification. OME-TIFF est un format open source image plus récent, bien que différentes installations peuvent être impossible d’enregistrer des séquences d’images TIFF supérieure à 4 Go.

Un élément clé de l’oléoduc de quantification est la génération de la chaîne de ratio et ensuite une procédure de segmentation d’image impartiale utilisant la fluorescence mCherry pour rechercher les cellules d’intérêt. De chaque objet trouvé, la taille de l’objet, la position du centre de gravité XY et le minimum, moyenne, et on calcule les valeurs d’intensité de fluorescence maximale pour chaque canal (y compris le canal de ratio). Ensemble, ces valeurs sont utilisées pour quantifier les variations intracellulaires Ca2 + à chaque validant dans l’enregistrement. Mesures de l’objet pour chaque validant sont ensuite exportés dans le fichier a.csv pour les analyses suivantes.

Une limitation majeure du protocole décrit ici est la dépendance sur le transfert des données sous différentes formes à travers un patchwork de produits logiciels. Une irritation supplémentaire est que certains des logiciels open source et gratuit alors que d’autres sont fermés, coûteux et inégalement mis à jour. Une amélioration majeure consisterait à utiliser ou développer un morceau de logiciel (idéalement open source) qui fournit des niveaux similaires de performance et de facilité d’utilisation de l’acquisition à l’analyse. Tel que noté ci-dessus, analyse logométrique double la taille du fichier et le temps requis pour compléter une expérience. Génération de pilotes de l’appareil qui peut être intégré dans les cadres personnalisables par l’utilisateur comme Bonsai permettrait aux images et autres flux de données à recueillir et à analyser en débit en temps réel, améliorer considérablement.

Perspectives d’avenir :

Tandis que nous suivons généralement les mouvements ver manuellement, suivi du centroïde ver détecté dans enregistrements infrarouge lumineux – ou fond noir devrait permettre des nœuds qui fournissent le réglage de la boucle fermée de position allure et automatisé de traitement d’image supplémentaire suivi (Figure 3 et données non présentées). La majorité des enregistrements fluorescence obtenus avec cette méthode est foncée et dépourvue de biologiquement intéressantes données. Sur capteur ou en temps réel après l’acquisition image processing techniques qui récolte des séquences d’images d’objets pertinents serait permettant un accroissement de la résolution spatiale et accélérer le pipeline d’analyse de données, en particulier si Z-tranches supplémentaires sont collectées pour chaque validant pour visualiser l’activité au sein de toutes les cellules préalables- et post-synaptiques dans le circuit.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une bourse de NINDS au KMC (R01 NS086932). LMN a été financée par une subvention du programme NIGMS IMSD (R25 GM076419). Les souches utilisées dans cette étude, c. elegans Centre de génétique, qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Nous remercions James Baker et Mason Klein de discussions utiles.

Materials

C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25×36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB Mean Ratio and XY centroid script Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders:  analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units):  time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces.
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 
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References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -. C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).

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Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).
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